Способ получения о-рибулозо-1, 5-дифосфата

309610 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республикависимое от авт. свидетельстваЧПК С 120 13 лено 28.Х 1.1969 ( 1380369/30-15) м заявкии исоедин ПриоритетОпубликовано ЗО.Х 1.1971, БоллстецКомитет по делам зобретеиий и открытий при Совете Мииистров СССР.11,1972 та опуоликования описания Авторыизобретения. Доман, А. К. Романова, Н. Г. Русинова и Г. Н. Литовченк рдена Ленина институт биохимии им. А. Н. Ба аявитель ы с ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Р-РИ БУЛ 030-1,5-ДИ ФОСФАТА зо сР-рибулозо,5 - дифосфат (С 5 Н 120 Р) соединение, являющееся акцептором углекислоты в уникальной реакции фиксации ее в процессах первичного биосинтеза органического вещества на нашей планете - фотосин теза и хемосинтеза. Фермент, ответственный за эту реакцию, - рибулозодифосфаткарбоксилаза - изучен очень мало. Наличие достаточного количества Р-рибулозо,5-дифосфата - необходимое условие для выяснения 10 механизма этой важнейшей фермешативной реакции карбоксилцровация,Принцип получения Р-рибулозо,5-дифосфата основан на ферментативном превратцении исходного продукта Р-рибозо-фосфат вР-рибулозо,5-дифосфат, протекающем в двестадии с участием ферментов рибозофосфатизомерами (Р - рибозо-фосфат-кетол-изомераза, индекс по номенклатуре ферментов 201966 г. 5.3.1.6) и фосфорибулокиназы (АТФ:Р-рибулозо-фосфат-фосфат-трано - фераза,индекс 2.7.1.19) .Схема реакции состоит в следующем:1. Р-рибозо-фосфат + рцбозофосфатимер аз а = Р-р и булозо-фосфат,11. Р-рибулозо-фосфат + АТФ + фосфорибулокицаза = Р - рпбулозо - 1,5 - дифофат+АДФ.Согласно известным прописям получение 30 Р-рпбулозо,5-дцфогфата состоит цз четырех основных стадий.1) Получение ферментцого препарата рцбозофосфатизомеразы из листьев шпццата.2) Получение ферментцого препарата фосфорибулокиназы также из листьев шпццата,3) Образование Р-рцбулозо,5-дцфосфата фермептагцвцзм путел пз рцбозо-о-фосфаГа и АТФ.4) Выделение препарата Р-рцбулозо,5-дцфосфата в виде барцевой соли и его очистка.Первые две стадии, если даже оци объединены, весьма трудоемки и цецадежцы. Это связацо с тем, что участвующие в сшггезе Р-рибулозо,5 - дифосфата фермецтцые препараты рцбозофосфатцзомер азы ц фосфорцбулокиназы по различным причинам часто бывают недостаточно активны илц содержат нежелательные примеси, Ферменты рцбозофосфатизомераза и фосфорцбулокццаза, локализованные в хлоропластах, находятся в слабо- щелочной среде. Клеточный сок листьев большинства видов растений имеет явно кислую реакцию ц часто содержит различные ингибиторы, что цсблагоцрцятцо отражается ца активности ферментов прц цх выделении из хлоропластов. Сравнительно редкое исключение представляют листья шпината, у которых реакция клеточноо сока близка к центральной. Однако активность рцбозофосфатцзоме3разы и фосфорибулокнназы, очевидно, зависит от физиологического состояния листьев, вследствие чего попытки получения ферментов не всегда успешны.В отличие от известных способов предлагается в качестве ферментного препарата для получения Р-рибулозо,5-дифосфата из рибозо-фосфата и аденозинтрифосфата (ЛТФ) использовать неочищенный бесклеточный экстракт тионовых бактерий ТЬоЬаспз 58 с( (штамм выделен в Институте микробиологии ЛН СССР).Эти бактерии обладают рядом свойств, использование которых дает большие преимущества. Тионовые бактерии ТЬоЬаспз 581( неприхотливы, растут достаточно быстро, не требуя ни дорогостоящих реактивов, ни сложного оборудования.Разработан следующий спосоо получения бариевой соли Р-рибулозо,5 дифосфата,Микроорганизмы выращивали в лабораторных условиях на минеральной среде состава:Хаг 8 гОз 5 гСаНРО 4 5 гКН,РО 4 3 гсЧдС 12 100 лсг1 ЯН 4 С 100 лсг на 1 л водопроводной воды с непрерывной аэрацией (Егпо 1 о, 1929, Ргос. Тгпр. Лса(1.То 1(о, Ч, 5). Урожай сырой биомассы с 5 л среды от 1 до 2 г, Разрушали клетки для получения бесклеточного экстракта озвучиванием суспензий микробов в десятикратном количестве 0,05 лсоль трис-С 1-буфера рН 7,5 (триогидрокси) метил аминометан, нейтрализованный соляной кислотой) при 0 С в аппарате МЯЕ мощностью 500 в при 20 килос(иклах в течение 10 асин, Экстракт отделяли центр ифугированием при 15000 д в течение 30 лсссн.При составлении ферментпой смеси для превращения рибозо-фосфата в Р-рибулозо,5-дифосфат была принята за основу методика, предложенная для определения фосфорибулокиназы (Л. Нпги 1 к, Мейо(Ь п Епуугпо 1 оду т. 5, стр, 258), МдС 6 Н 20 - 2000 лслсоль. Навеску 406,7 лсг растворяли в 5 лсл воды, перегнанной из стекла.Цистеин солянокислый - 500 лслсоль. Навеску 78,8 лсг растворяли в 2 лсл воды и нейтрализовали сухим трис-буфером до рН 7,5.Рибозо-фосфат бария переводили в натриевую соль. Для этого 2000 лслсогь рибозо- фосфата бария (навеска 840 лсг с учетом содержания в препарате 15% гигроскопической воды) растворяли в 10 лсл охлажденной до 0 С 0,1 н, соляной кислоты и добавляли 2000 млсоль (284 лсг безводной соли) сульфата натрия. Осадок Ва 504 удаляли центрифугированием, а супернатант нейтрализовали до рН 7,5 добавлением сухого трис-буфера.Лденозин-фосфат - 2000 лслсоль, патриевая соль. Навеску 1267 лсг растворяли в 10 лсл перегнанной из стекла воды и пейтрализова 309610 Таблица 1 фосфор Р-рибулозо,5-дифос- фата ссинеральный43,5 78,4 65 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 4ли до рН 7,5 добавлением сухого трис-буфера,Проведение реакции получения Р-рибулозо,5-дифосф ата.К 30 лл ферментного препарата добавляли2 сил раствора цистеина, 5 лл раствора хлористого магния, 10 м г раствора рибозофосфата натрия и 10 лс,г раствора ЛТФ. Конечный объем смеси около 60 лсл.Реакцию проводили в атмосфере аргона,который может быть заменен другим инертным газом, не содеряащим углекислый газ,при комнатной температуре с подтитровкой1 н. раствором МаОН для поддержания рНферментной смеси 7,5 - 7,8. Реакция продоли(алась от 3 до 5 лсин. Затем ферментнуюсмесь охлаждали до 4 С, белок осаждали5/,-ной трихлоруксусной кислотой (конечнаяконцентрация) и осадок удаляли центрифугированием.Очистка и выделение Р-рибулозо,5-дифосфата бария.В основу дальнейшей процедуры частичнойочистки и выделения бариевой соли положена методика Хореккера и сотр (Ногес 1(егВ. Х. е 1 а 1., Мейо(з п Епкугпооду, 1957, т, 3,стр. 193, с некоторыми модификациями), Дляудаления нуклеотидов (ЛТФ и ЛДФ) полученный раствор обрабатывали 60 г актпвированного угля марки БЛУ, предварительно промытого 1 н. НС и затем 10/о ТХУ и отмытого водой до нейтральной реакции. лКпдкучофазу отделяли от угля фильтрованием наБюхнеровской воронке с отсасыванием, угольмногократно (4 - 5 раз) промывали водой по100 лс г, каждый раз суспендируя уголь в воде. Опытный раствор и промывпые воды ооъединяли и нейтрализовали до рН 6,0 остороя(нылс добавлением Р 4 аНСОа.Затем к раствору добавляли 2,и г 1 н, уксуснокислого бария и бариевую соль Р-рибулозо,5-дифосфата осаждали добавлением960/о-ного этанола до конечной концентрации30 об О/о Осадок промывалие 80%-ньсм этанолом и высушивали до постоянного веса в вас(умме эксикаторе над РгОа.Полученный продукт весил 300 лсг, что соответствует выходу 25% от теоретического.Препарат Р-рибулозо,5-дифосфата весьма гигроскопичен. Он получается в виде дибариевой соли, склонной к присоединению крисгаллизационпой воды.Лпализ полученного препарата па содержание фосфора (в /о) представлен в табл, 1,309610 Таблица 3 Стоимость Реактива иа одно получение, руб Количествореактива наодно получение 1 гг Стоимость за1 кг, Раб Реактив 10 9,00 4,00 0,75 0,30 0,16 0,06 0,03 10900,002640,015012,001100,001,000,25 840 13, 00 0,5 2500 150 60 100000 510 100000 2000 2000 180.ЧАС1 Й,СТрис-С 1-буфсрАргонР;О; Таблица Радиоактивность, илп(,1 гин Препарат Контроль (без Л-рибулозо,5-дифосфат)Опыт 0,05 8500 3700 170 150 0,01 0,12 100000 25 Составитель М. ДранишниковРс,1 аьтор Н. Воликова Твхред Е. Борисова Коррсьтор Л. Орлова Заказ 154/7 Изд,1790 Тираж 473 ПодписиисЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совстс 31 ииистров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 45 Типография, пр, Сапунова, 2 Фосфор Р-рнбулозо,5-дифосфата определяли но количеству щелочслабнльного фосфора.Элементарный анализ показал соответствие формулеСвНвОггРВа, 7 НзО.Экспериментальные данные, %: С 8,60; 8,69; И 2,81; 3,09; Р 8,8,13; 7,72.Рассчетныс даннье, %: С 8,49; Н 3,10; Р 8,79.В табл. 2 дана ферментная активность препарата. Состав ферментной смеси для проверки способности Р-рибулозо,5-дифосфата акцептировать углекислоту, 0,голь/лгл ферментной смеси:МдС 1, 10Глютатион восстановленный 10 КаНСыОз или 1 Х)аСь 10 з 50 и бесклеточный экстракт из хемосинтезирующих бактерий или гомогенат высших растепий, (Данные отдельных опытов не сравнимы между собой и имеют качественный карактер, так как использовались различные источники фермеига и нестандартныс препарагы радиоактивной соды). Результаты ферментативной проверки свидетельствуот о высоком качестве полученного препарата, как реактива - акцсптора С 02.Расчет себестоимости препарата Р-рибулозо,5-днфосфата, полученного по предлагаемому способу.Так как предлагаемый способ нс требует использования сложнык дорогостоящих приборов (за исключением обычной центрифуги и генератора ультразвука ЧЬЕ), то затраты, связанные с амортизацией оборудования, включая эти приборы, незначительны, Прн однократном получении препарата они не превышаот нескольких копеек и практически могут быть отброшены. Поэтому основные раскоды па приготовление Р-рибулозо,5-дифосфата составляют стоимость реактивов и оплата труда.Расходы на одно получение 1300,11 г) препарата Р-рибулозо,5-днфосфата приведены 5 в табл. 3. Стоимость расхода электроэнергии ннчтожна (меньше 1 кои), накладные расходы также меньше 1 когг и прп одноразовом получс нии могут быть отброшены, оплата труда1 три рабочих дня старшего лаборанта) 15 руб. Итого около 30 руо.Таким образом, все необходимые расходына однократное получение Р-рнбулозо,5-дн фосфата по предлагаемому спосооу прн выходе 300,1 гг примерно в 10 раз ниже, чем сущсству 1 ощая его цена. Прн систематическом пол чении стоимость реактива мОжст значительно снижена.40Прсдмст нзобретс и и я1. Сносоо получения Р-рнбулозо,5-дн 11 Осфата нз рибозо-фосфата н адснозннтрнфосфата с использованием бнокаталнзатороп, 45 ог,гикаОп 1 ийся тем, что, с целью сокращеннстоимости готового продукта, в качестве бнокаталнзаторов берут оесклеточный экстракт штамма Т 11 ОЬас 111 пз 58 К (Инст 1 ггут микробиологии ЛН СССР).50 2. Способ по п. 1, отлинагоигги 1 ся тем, чтоштамм Т 11 ОЬас 111 пз 58 К выращивают на среде Егпо 1 о в аэробных условиях, предпочтительно при 30 С н рН среды начальном 5,2,конечном 2,0.