Способ получения антибиотиковметаболитов

СПИ ИЗОБ и 1 56392 Сова Советских Социалистических Ресоубяик(31) 53283/74 (33)Опубликовано 30. 1) М 12 Р 9/00 Государственный комитет Совета Министров СССР 53) УДК 615.779.9(72) Авторы изобретени Иностранцы Каролина Каронелли,Жанкарло Ланчини(Италия) Иностранная фирма руппо Л епетит С.п, А,франчес мон иорги енТ озу, целлюлозу. Изобретение относится к области микробиологии.Целью изобретения является получение антибиотиков-метаболитов.Эта цель достигается тем, что штамм АсЫ- пор 1 апез с 1 агЬайпепв 1 з АТСС 31049 или Ас 11- пор 1 апез 11 впг 1 ае АТСС 31048 выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с,последующей экстрах цией целевого продукта и разделением его на фракции.Предлагаемые антибиотики являются новыми и способ их получения в патентной и научно-технической литературе не описан. 1Штаммынпродуценты антиоиотика получены из почвенных проб, отобранных в Тегпозв 1 (Италия), коллекция А (6353), и в СтагЬай ВгЫде (Индия), коллекция А (10889). Оба штамма входят в состав исходной культуры, 2 хранящейся в коллекции АТСС под31 048 и 31049.Штамм Ас 11 пор 1 апев 11 дпг 1 ае АТСС 31 048 хорошо растет на различных агаровых средах, Атар с овсяной мукой. Колонии диаметром около 5 мм, обнаруживают изрезанные очертания, слабо выраженные бороздки в радиальном направлении и центральную впадину. Во душных мицелиев не образует. Агар с овсянои мукой, глицерин-аспарагин-агар, глюкозный 3 агар Чапека. Обильное образование спорангиев разной формы и величины в зависимости от среды. На ангаре с овсяной мукой спорангии имеют правильные очертания, форму от сферической до овальной, величину 15 - 25 мкм. Сферические споры подвижны, диаметр 1,5 - 2 мкм, В различных средах образуется янтарно-желтьш растворимый пигмент.Штамм Ас 11 пор 1 апез дагЬайпепз 1 хорошо растет на различных питательных агарах. Поверхность непрозрачна, обычно от,шероховатой до морщинистой. Воздушных мпцелпев нег, за исключением рудиментарных форм на не. которых средах, Вегетативный мицелий слегка разветвлен, диаметр около 1 мкм. Умеренное развитие спорангиев только на агаре с малеатом кальция, форма шаровидная, поверхность неправильная, часто дольчатая, диаметр 7,0 - 12,0 мкм. После разрыва спорангиев иногда наблюдается вырывание спор. Подвижные споры почти:шаровпдны, диаметр 1,0 - 1,5 мкм.В табл. 1 приведены культуральные признаки штаммов АТСС 31048 и 31049 в различных стандартных средах. Признаки определяют после выдерживания культуры при 30 С в течение 6 - 14 суток.Температура выращивания колеблется в пределах от 18 до 42 С, предпочтительно 28 - 37 С.Штамм Ас 11 пор 1 зпез о агЬа йпспвгв АТСС 31049 усваивает фруктозу, рамнозу, маннпт, ксилозу, арабинозу, салпцин, сахарозу, маппозу, лактоз, глюкозу.Не усваивает инозит, рафпн563921 Таблица 1 Культуральные признаки штамма Среда 31 018 / А 6353 31 049 А/1 С 889 Дрожжевой экстракт - солодовый агар Овсяная мука Неорганические соли в крахмальный агар Пептон-дрожжевой экстракт - железный агар Тирозиновый агар Питательный агар Картофельный агар Агар Чапека Обильный рост, гладкая поверхность,оранжевая Яичный агар Картофель Глицерин в аспарагиновг агар Агар с овсяной мукой Агар Хики и Треснера Глюкозный агар Чапека Глюкозо-аспарагиновый агар Агар БеннетаАгар с малеатом кальция Агар со снятым молоком Пептон-глюкозный агар Сыворотка Ле ф флера Обильный рост, моргцинистая поверхность, янтарная Умеренный рост, гладкая поверхность, непрозрачная от кремового цвета до оранжевого Умеренный рост, гладкая поверхность, темно-оранжевого цвета Умеренный рост, гладкая поверхность, оранжевого цвета Незначительный рост, шероховатая поверхность, темно-коричневая, коричневый пигмент Обильный рост, твердая поверхность кофейного цвета, слабо-коричневый пигмент Обильный рост, твердая поверхность, пигмент оранжевый, рудиментарный воздушный мицелий Обильный рост, морщинистая поверхность, светло-коричневая Незначительный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевая, рудиментарный воздушный мицелийОбильный рост, твердая поверхность, интенсивно-оранжевая Умеренный рост, твердая поверхность, от оранжевого до светло-корич- невого Обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до светло- коричневого, рудиментарный воздушный мицелий Обильный рост, морщинистая поверхность, светло-оранжевого цветаУмеренный рост, твердая поверхность, от кремового цвета до оранже- вого Обильный рост, морщинистая поверхность, интенсивно-оранжевая Незначительный рост, твердая поверхность, светло-оранжевого цвета Очень незначительный рост, гладкая поверхность, полупрозрачнаяОчень незначительный рост, гладкая поверхность, от светло-оранжевого до янтарного цветаОчень незначительный рост, морщинистая поверхность, оранжевого цвета Обильный рост, слегка морщинистая поверхность, светло-оранжевый, светло- янтарного цветаОбильный рост, гладкая, плоская поверхность, светло-оранжевого цвета, несколько спорангиев светло-желтого цвета; пигмент растворимый Обильный рост, гладкая поверхность, оранжевая, несколько спорангиев светло-желтого цвета; пигмент растворимыйОбильный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевого цвета; пигмент растворимый, светло-желтыйУмеренный рост, гладкая поверхность, оранжевая Обильный рост, гладкая поверхность, розово-янтарная, хорошее образование спорангиев, розово-янтарный пигментОбильный рост, гладкая поверхность, светло-оранжевого цвета топаза, хорошее образование больших спорангиев, желтый растворимый пигментОбильный рост, гладкая поверхность, розово-янтарная, обильное образование спорангиевОбильный рост, гладкая тонкая поверхность, оранжевая, обильное образование спорангиевОбильный рост, гладкая поверхность, оранжевая, несколько спорангиев Обильный рост, гладкая поверхность,оранжевая Обильный рост, гладкая пзв рхносз ь,янтарного цвета Обильный рост, твердая поверхность, светло-оранжевого цветаОчень незначительный рост, гладкая поверхность, бесцветная, несколько спо- рангиев Обильный рост, слегка твердая нов-рхнзсть, интенсивно-оранжевая, желтая, растворимый пигментОчень незначительный рост, светло- оранжевого цвета, умеренное образование спорангиевОбильный рост, гладкая поверхность, светло-кремового цвета, умеренное образование спорангиевОбильный рост, морщинистая поверхность, интенсивно-ораннсевого цветаОчень незначительный рост, светло- оранжевого цвета Очень незначительный рост, морщинистая поверхность, светло-оранжевого цвета5Штамм Лс 1 шорапез 11 ццг 1 ае ЛТСС 31 048 усваивает инозит, фруктозу, рамнозу, ксилозу, арабинозу, мантозу, глюкозу. Не усваивает маннит, рафинозу, целлюлозу, салицин, саха- розу, лактозу.Штамм Лс 1 шор 1 апез дагЬайпепв 1 з АТСС 31049 гидролцзует крахмал, тирозин, не гидролизует казеин, малеат кальция. Образовывает НзЯ, меланин, не коагулирует лакмусовое молоко, нитраты восстанавливает, разжижаетжел атину.Штамм Ас 11 пор 1 апез 11 дцг 1 ае АТСС 31048 гидролизует крахмал, казеип, не гидролизует тирозин, малеат кальция, меланин; НзБ не образует; не коагулирует и не пептонизирует лакмусовое молоко; нитраты не восстанавливает; желатину не разжижает.Для получения новых антибиотиков штаммы выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли. Штаммы обычно подвергают предварительному выращиванию в качалочной колбе до получения значительного количества антибиотиков,;после чего культурой засевают питательную среду в ферментере.Выращивание продолжают при температуре 25 - 35 С в аэробных условиях до получения значительного количества антибиотиков. Контроль за концентрацией антибиотиков осуществляют диффузионным методом на агаре с помощью Ьагс 1 па 1 ц 1 еа в качестве испытуемого микроорганизма.Полученные антибиотики выделяют из ферментационной жидкости обычными приемами, например экстракцией органическими растворителями, в которых антибиотики нерастворимы и которые не смешиваются с водной средой, такими как Сз - С 6-алканолы и (С 1 - С 4) -низшие галоидированные углеводороды.Органическую фазу отделяют от водной среды, концентрируют до небольшото объема и выдерживают 10 - 15 ч при низких температурах, Выпавший осадок затем отфильтровывают.Бумажной хроматографией или тонкослойной хроматографией сырого продукта через силикагель и последующим микробиологическим,развитием с помощью ЯарЬу 1 ососсцз ацгецз обнаруживают два активных компонента - метаболиты А и В, причем последний в большем количестве.Метаболиты А и В отличаются друг от друга величиной Й, находящейся в зависимости от системы растворителей.Метаболиты А и В очищают и выделяют обычными приемами, например противоточной экстракцией в системе растворителей, в которой метаболиты имеют разные коэффициенты распределения. Метаболит В получают в виде мононатриевой соли, которая может превра,щаться в другие соли с щелочными или щелочноземельными металлами или в свободную кислоту, обычными приемами.Метаболиты А, В (гардимицин) и пх соли 5 10 15 20 25 30 35 :0 45 50 55 61 05 с щслочпыми и щелочноземельными металла ,ми, а также метаболпт С оказывают хорошее бактерицидное действие ш ч 1 го и ш Йо, в частности гардпмицпн оказывает отличное действие 1 п л 1 го на,грамположительные бактерии при концентрации 1 - 50 мкт/мл. Гардимицин действует па изолированные и клинических условиях иламмы Ягер 1 ососсцв.Кроме того, градимнцнн проявляет сильнос действие ш яо на инфекции у мышей, пораженных бактериями родов Р 1 р 1 ососсц и Ягср 1 ососсцз. Он имеет очень низкую токсичность: 1.0 зо выше 1000 мг/кг внутрибрюшинно и около 200 мм/кг внутривенно.П р и м е р 1. Для получения антибиотиков ,штамм Лс 11 пор 1 апез схагЬас 1 1 пепз 1 в ЛТСС 31049 подвергают предварительному выращиванию в аэробных условиях в питательной среде до достижения значительного количества антибиотиков. Культура, выращиваемая на качалке, может быть следующего состава, г/л:Мясной экстракт 3,0Дрожжевой экстракт 10,0СаСОз 4,0Крахмал 25,0Водопроводная ьода До 1000 (мл) Колбы встряхивают 24 ч при температуре 28 - 30 С, затем предварительными культурами (1 л) засевают ферментеры, содержащие 10 л питательной среды следующего состава, г:Мясной экстракт 40 Пептон 40 Дрожжевой экстракт 10 ХаС 1 25 Мука из соевых бобов 100 Глюкоза 500 СаСОз 50 Водопроводная вода До 1000 (мл)Питательные среды засевают в аэробных условиях с,перемешиванием при температуре 28 - 30 С. В определенных интервалах контролируют количество образующихся антибиотиков методом диффузии с помощью Яагс 1 па 1 ц 1 еа в качестве тест-микроба. Максимальное образование антибиотиков достигается через 96 - 120 ч.Ферментационную жидкость доводят до значения рН 8,0, затем фильтруют с помощью Ну 11 о зцрег-се 11 в качестве вспомогательного фильтрующето средства, Мицелий выбрасывают и фильтрат экстрагируют бутанолом (половиной объема фильтрата). Органическую фазу отделяют от водной, а затем после промывания подкисленной водой (рН 4,0) кон нтрируют до 1/10 объема и выдерживают 1 О - 12 ч при 3 - бС.Осадок, полученный на фильтре, промывают бутанолом и высушивают под вакуумом при комнатной температуре. Выход 3,0 г. Хроматографией с помощью бумаги или на силикагеле и последующим проявлением пятен с помощью тест-микроба Яар 11 у 1 ососсцз ацгецв обнаруживают два компонента с различными значениями в зависимости от растворителей -/563921 77,., Ф метаболиты А и В (гардимицин). Сырую смесь подвергают дальнейшей очистке растворением в воде (30 мл), Раствор диализируют 16 ч против дистиллированной воды, а затем концентрируют в вакууме до небольшото обь ема. Получают еще раз смесь метаболитов Л и В (1,5 т), которые разделяют и очищают несколькими противоточными экстракциями, исходя из различных коэффициентов распределения в определенной системе растворителей 10 бутанол: натрий-калий-фосфатный буфер М/15 (рН 7,2): гексан=1: 1: 0,1. Коэффициенты распределения составляют 0,3 для метаболита А и 0,8 для гардимицина. После 100 экстракций получают 0,450 г мононатриевой со ли гардимицина.Маточные растворы после экстракции буч с к е и смеси метаболи ов А и Таблица 2 1 о,1 см Растворителв макс., к,к 273 (плечо)280299 Метанол 26 24 273 (плечо)279288 ЧаОН (0,1 и.) 26 22 О 73 (п течо)279288 НС (0,1 и,) 26 22 фосфатиый буфер (РН 7,38) 273 (плечо)279288 24 20 2025 30 35 :10 45 50 55 60 Попппсное М 574 Тпр 11 ж 563 таноом и о а 1 д н я тВ концентрируют до небольшого объема и выливают в избыток петролейного эфира. Сразувыпадает осадок, который отфильтровывают.Хроматографией в вышеуказанных условияхполучают продукт со значением Яо отличнымот значений Р 1 метаболитов А и В в тех жерастворителях, - метаболит С.Пр и м е р 2. По методике примера 1 выращивают штамм АсЫпор 1 апез 11 дцг 1 ае АТСС31048 в аэробных условиях при температуре28 - 30 С. Получают 1,1 г смеси метаболитов Аи В (обнаруживается хроматографией), которую очищают и разделяют как описано в примере 1. Получают 0,2 г мононатриевой соли гардимицина, представляющей собой оелы йаморфный порошок с амфотерным характером. Ее изоэлектрическую точку (4,2) определяют методом электрофокализации, После,гидролиза в 6 н. НС 1 при температуре 120 Св запаянной трубке в течение 16 ч хроматографией обнаруживают следующие аминокислоты: валин, серии, тлицин, глютаминовуюкислоту, изолейцин, лейцин и аланин, Послещелочного,гидролиза Ва (ОН), при 110 С взапаянной трубке в течение 15 ч хроматографией выявляется и триптофан,В результате анализа продуктов кислотно:огидролиза обнаруживают другие аминокислоты неизвестной структуры, часть которых содержит серу.Мононатриевая соль гардимнцина имеетточку плавления 260 С (разлож.), молекулярный вес 200 о - 2168, элементарный состав, "1,:С 48,7 - 48,6; Н 6,7 - 6,6; Х 11,8 - 12,2; 8 5,3 5,5; Иа 1,1; НО 3,6 - 3,3.Хроматографические данные гардимнцинапредставлены в табл, 2,ИК-спектр гардимицина, Характерные полосы поглощения в ньюеле наблюдаются при следующих частотах, см - . 3280,2920 - 2840 (ньюель), 1650, 1520, 1455 (ньюель), 1260, 1045, 990,720. Удельное вращение; ассо = - 44 (с==0,5 о/о ДМФ)Растворимость: растворим в воде, водномКаНСОа, разбавленных водных растворах щелочных гигдроокисей, горячем метаноле, ДМФ,11 П( 3 акаа 16806 1 вл. ледяной уксусной кислоте; нерастворим в раз. бавленных минеральных кислотах, бензоле ацетоне, хлороформе, СС 14, С 2 - Са-алифатиче ских алканолах, тетратидрофуране.Из мононатриевой соли гардимицина мож но получить следующие производные: свобод. ную кислоту, динатриевую соль, кальциевую соль,Свободная кислота: 1 г мононатриевой соли гардимицина растворяют в 150 мл воды, добавляют 10 о/о-ный водный раствор НС 1, доводя рН до 2,5, а затем два раза экстрагируют 75 мл бутанола, насыщенного водой. Экстракты объединяют и концентрируют при 45 С до 1/20 объема. После выдерживания при 4 С в течение 12 ч выпадает осадок, который промывают петролейным эфиром и высушивают в вакууме при 40 - 45 С. Получают 0,950 г продукта, разлагаю 1 цегося в пределах от -250 до 300 С.Динатриевая соль: 1,0 г мононатриевой соли растворяют в 150 мл воды, добавляют 1/10 н.1 аОН, доводя рН раствора до 9,6, затем раствор лиофилизуют. Получают 0,900 г продукта с т. пл, 250 С.Кальциевая соль: 0,3,г мононатриевой соли растворяют в 20 мл воды, затем к раствору при перемешивании медленно прибавляют несколько порций насыщенного раствора СаС 1 до полного осаждения. Осадок фильтруют, вь 1- сушивают в вакууме и растворяют в 10 мл ацетона. После выливания раствора в 200 мл эфира выпадает осадок, который фильтруют и высушивают в вакууме при 40 - 45 С, Получают 0,2,г продукта, разлагающегося при 330 - 340 С.Формула и зо б ретенпяСпособ получения антибиотиков-метаболитов, отличающийся тем, что штамм Лс 11- пор 1 апез дагЬас 11 пепв 1 з АТСС 31049 или Лс 11 пор 1 апез 11 дцг 1 ае АТСС 31 048 выращивают в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующей экстракцией целевого продукта и разделением его на фракции.