Способ получения рифамицина р, и

СПИ ИЗОБ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(61) Дополнительн (22) Заявлено 28,0 (23) Приоритет (31) 37 91 3/74 (43) Опубликован (46) Дата опубли С 12 Р 9/О Государственный номнт Совете Иннистроо ССС по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретен Иностранная фирмауппо Лепетит С.п,Аф (Италия 71) Заявит 54) СП ПОЛУ Ч ится к микробиологити и касается получезобретение от й промышленн вето рованы в коллекциикачестве Носат ат а1 06 4-31 066,Эти штаммы депони АТСС и определены в наес(1 е 1 гт аттеа АТСС 3Культурально-морфо Штамм АТСС 31064 нич вски-воронкообразны метр 2-3 мм, краснов изн огические п Я) - кол е, закатанны и кое с охдушный ветвле то-коричневы м овый,Споры цилиндриобильный рост со тью, цвет лесноаями, розово-бебильный нжевый,орапигмеону,нт,Обиль крыт ння антибиотиков,Предлагаемый антибиотик и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.Целью изобретения является получение рифамицина Р,(,и ЦЭто достигается тем, что штамм МосагЬа тттей 1 еггатеаАТСС 31064 (П) или 10 Мосагй а тттеайеггапеа Лт С С 3106 5(ММ-6), или Касагича тпеЬйеггаттеа АТСС 31066 (М) выращивают в аэробных условиях при температуре 25-37 оС на питательной среде, содержащей источники угле- )5 рода, азота и минеральные соли при рН 6,4- 8,5, затем из ферментационной среды выделяют комплекс целевого продукта и разделяют его на отдельные компоненты Р, Я К и 20Мутантные штаммы йосагйа птеЬЙггапеа АТСС 31064 (Д),Мосагйа птей 1 еггапеа АТСС 31065 (ММ-6) и Йосагс 1(а птеатГеггат 1 еа АТСС 31066 (М) получают обработкой АТСС 1 368 5 азотно гой кислотой ф ИФАМИЦИН 1 Р, С, Я иО производными нитрозогуанндинов в качестмутагенных агентов или облучением рентновскими лучами или ультрафиолетовым ровым растворимым пигмеимицелий слегка серовато-розный диаметр 0,6-0,8 ммк,ческие 0,8-1 ммк.Агар с овсяной мукой,слабо складчатой повврхносго ореха с оранжевыми кржевый растворимый пигментГлюкозо-аспарагнновый арост с гладкой поверхностьюсветло-желтый растворимыйГлюкозный агар по Эмеррост с очень складчатой и иКрахмальный агар (среда4). Умеренный рост с гладкой поверхностью, глубокоорвнжевый, следы соломенно-желтого раствоповерхностью, кирпичного цвете, янтарно- римого пигменте, крахмальный гидропиз; отжептый растворимый пигмент. рицательный,Питательный агар. Умеренный агар с глад Физиолого-биологические признаки, Желакой и тонкой поверхностью, светло-оранже- тин гидропизует, нитретную среду не восстевый, 5 невпивеет, лакмусовое молоко не коагулируЛгвр Придхэма, Умеренный рост с глад- ет и не пектониэирует, крахмал малат кальция,кой и тонкой поверхностью, янтарно-желтый, нитреты не гидрилизует,слабо розовато-оранжевый воздушный мице- Усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу,лий, розоватый растворимый пигмент, мвннозу, фруктозу, пактозу, сахарозу, рамКрахмепьный агар (среда4), Умерен нозу, раффинозу, маннит глицин, инулин,мепьный рост с гладкой поверхностью, оранжевь/Й, тозу, гвлактозу, глицеРин.обильный воздушный мицелий, розовый, одиль- Не усваивает инозит, салицин, сукцинатное образование спор, желтый растворимый натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, дуцит,пигмент, крахмальный гидролиз: отрицетель целлюлозу.ный, Культурально-морфологические признаки.физиолого-биологические признаки, Гидро Штамм АТСС 31066 (М), Колонии колиэует жепетин, тирозин, казеин, малат кель- нически-воронкообразные, закатаннь 1 е, дивция, не гидролизует крахмал, нитраты, Лак- метр 2-3 мм, оранжево-коричневые с янтармусовое молоко не коагулирует и не пекто- но-жептым растворимым пигментом, Воздушнизирует, Нитратную среду не восстанавли- р 0 ный мицелий розовый до розово-оранжевого,вает, Усваивает арабинозу, ксилозу, гпюко- разветвленный, диаметр 0,6-0,8 ммк, спозу, маннозу, фруктозу, лвктозу, сахарозу, ры цилиндрические 0,8-1 ммк,иноэит, рамнозу, салицин, маннит, гпицин, Агар с овсяной мукой обильный рост синулин, мапьтозу, галектоэу, глицерин. гладкой поверхностью, темно-янтарно-желНе усваивает рвффиноэу, сорбит, сукци- д тый, следы розового воздушного мицелия,нат натрия, цитрат натрия, ацетат нетрия, темно-янтарно-желтый растворимый пигмент.дульцит, целлюлозу. Агар Чапеке-Доксв, Обильный рост с гладШтамм АТСС 31065 (ММ-6) - это кой поверхностью, оранжево-розовый, общтьколонии конически - воронкообразные, зека- ный воздушный мицелий, розово-оранжевый,танные, диаметр 2- 3 мм, глубокоорвнже- з 0 следы светло-желтого растворимого пигменвый с темно-оранжево-желтым растворимым та.пигментом, Воздушный мицелий розовый до Глюкозо-аспарагиновый агар, Очень хоросветпо-оранжевого, разветвленный, диаметр ший рост, золотистый, нет растворимого пиг 0,6-0,8 ммк. Споры цилиндрические 0,8 мента,1 ммк, З 5 Гпюкозный агар по Эмерсону. ОбильныйАгар с овсяной мукой, Обильный, ост с рост со складчатой поверхностью, темно-янгладкой поверхностью, оранжевый, сп ды ро- терно-желтый, темно-янтарно-желтый пиг. зового воздушного мицелия, мало спор, ро- мент.зово-бежевый растворимый пигмент, Питательный агар. Очень хороший рост сАгар Чапекв+Доксв, Рост хороший с глад-ю 0 тонкой и гладкой поверхностью, оранжевый,кой поверхностью, оранжевый, светло-оран- нет растворимого пигмента,жевый воздушный мицелий, Агар Придхэма, Обильный рост, слегкаГлюкозо-аспарагиновый агар, Очень сла- покрытый корой, янтарно-коричневый, следыбый рост с гладкой поверхностью, светло- розоватого воздушного мицелия, янтарно-кооранжевый, нет растворимого пигмента, Глю ричневый растворимый пигмент,козный агар по Эмерсону, Обильный рост с Крахмальный агар (среда4). Обильочень складчатой и покрытой корой поверх- ный рост с гладкой поверхностью, оранжностью, кирпичного цвета, янтарно-желтый вый, следы розового воздушного мицелия,растворимый пигмент, светло-желтый растворимый пигмент, крахПитательный агар, умеренный рост со 50 мапьный гидролиз: отрицательный,складчатой и тонкой поверхностью, светло- физиолого-биологические признаки.оранжевый, нет растворимого пигмента. Желатин, казеин, тирозин гидропизует,/"ьАгар Придхэма, Обильный рост с гладкой крахмал, малат кальция, нитраты ие гидроповерхностью, кирпичного цвета, розовый воз- лиэует, нитратную среду не восстайевливает,душный мицелий, желтый растворимый пиг лекмусовое молоко не коагулирует и не пенмент,тонизирует.Усваивает арабинозу, ксипозу, глюкозу,манноэу, фруктозу, лактозу, сахерозу, инозит, рамнозу, салицин, маннит, глицин, мельтоэу, гелактозу, глицерин.,Не усваивает раффинозу, сорбит, сукцинат,натрия, цитрат натрия, апетвт натрия, инулин,дуцит, целлюлозу,Выращивают штвммы на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники 5углерода и азота до тех пор, пока в питательной среде не будет доказано наличиезначительного количества рифвмицина, послечего экстрагируют. Выращивание проводятпри перемешиввнии и глубокой аэрации питаОотельной среды при температуре 25-37 С(предпочтительно при 28 оС).В качестве источников углерода применяют глюкозу, гапвктозу, лактоэу, сахарозу,мальтоэу, глицерин, маннит. Подходящимиисточниками азота являются, например, аминокислоты и их смеси, пектиды, протеины иих гидролиэаты, например пелтон, дрожжевойэкстракт, мука соевых бобов, полученная вымачиввнием кукурузы в воде, рыбная мука, 2 Омясные экстракты и водные фракции из хлебных семян. Ферментация длится 180-200час, причем величина рН в начале 64-66к концу повышается до 70-8,5,После окончания ферментации рифамицинывыделяют следующим образом,Ферментационную среду отфильтровываютпри рН 7,0-8,5, фильтрат быстро подкисляют (предпочтительно при величине рН ниже5 для обеспечения стабильности антибиотиков). После этого их экстрагируют не смешивающимся с водой растворителем например хлороформом, бутанолом этилпропил-,бутил- или амипацетатом, цричем,объемноесоотношение среды к растворителю в зависимости от растворителя составляет от 2:1до 10:1,Остающееся в мицелии количество антибиотиков экстрагируют не смешивающимся сводой растворителем и потом соединяют сорагнической фазой, содержащей главную аопю рифамицинов, но можно также экстрагировать смешивающимся сводой растворите 45лем, например ацетоном. В этом случае жидкость отфильтровывают, в ацетон выпаривают в вакууме. После этого рифамицины экстрагируют не смешиввющимся с водой растворителем,50После перевода антибиотиков в растворенный вид выпаривают раствор в вакууме досуха предпочтительно при температуре нйже30 оС,Сырой экстракт рифамицинов очищают хро-,матографическп на колонке силикагеля, Перед хроматографией растворяют экстракт вфосфатном буфере при рН .7,0-8,0 и затемобрабатывают слабым окислитепем. Буферный раствор потом экстрагируют не смешиввюшимся с водой растворителем, . Экстракт содержит новый рифамицин К.Экстрагированный буферный раствор поакисляют до рН 2-4 и потом снова его экстрагируют указанным выше образом, ЭкстрактсодЕржит новые рифвмицины К 6 и 9;дальнейшую очистку новых рифамициновпроводят хроматографическим путем на колонке, содержащей подходящий вдсорбент,например силикагель, с подходящей смесьюрастворителей в ачестве элюента.П р и м е р 3 Мутантный штамм моеагсй щей 1 еггатев АТСС 81064 выращиваютв течение 6-8 дней на агаре Беннета притемпературе 28 С, Полученной скошеннойокультурой при стерильных условиях инкубируют две колбы Эрленмейера емкостью 500мл, содержащие 100 мл гетативной срвдыследующего состава, г;Экстракт говядиныДрожжевой экстракт 5Пептон 5Гидролиэат каэеина 3Глюкоза 2 ОйаС 1 1,5Н 0 ,О,о 1 лВеличину рН при помощи раствора едкого натрв доводят до 7;3, Колбы в течение72 час выдерживают на качалке, после чегоинкубируют предварительный возбудитель брожения емкостью 10 л, содержащий 4 л указанной вегетативной среды. Затем выращива- .ние осуществляют при аэрации, температуре28 оС и перемешивании при 300 об/мин,После 48 час получают 7-10%. плотноукомплектованных. клеток, Затем используютстеклянный бродильный резервуар емкостью10 л, содержащийл ферментационной жидкости следующего состава, г:Арахисовая мука 25Мука иэ соевых бобов 5(НН)е МООе чНФ 0 0,85Н 0 До 1 пВеличину рН доводят до 7,8 при помощи раствора едкого патра. Затем стерипизуют60 мин при температуре 120 оС, после чего рН доводят до 64, для инкубации прцме 5780 1:420156 400,851001 7няют количество предварительного возбудителя брожения, соответствующее 5%-номусодержанию бродильного резервуара.Ферментацию проводят при температуре28 С при аэрации с перемешиванием прио750 об/мин. В качестве антивспенивателяприменяют силикон А, Культуральная жидкостьв ходе ферментации приобретает характерный красно-бурый цвет, После 200 час получают определенный объем плотно уком 0плектованных клеток, Если рН составляет7,5, то культуру снимают.П р и м е р 2. Культуру Иосагйа твдйвггапВО АТСС 31064 получают, какв примере 1, и выращивают в колбе на качалке. Для получения предварительной культуры ийкубируют стеклянный бродильный резервуар емкостью 10 л, содержащий 4 л среды следующего состава, г:Глюкоза 5 20Арахисовая мука 7,5СаСО 1,65и 507 Ц,О 0,33Н 2 0 ц 033Уе 07 Н,О 33 25Хп 50 7 Нр 0 16,5Мп 50 чН 0 1,3НР,Оо 1 лВеличину рН доводят до 7,5, Затем стерилизуют в течение 50 мин при 120 оС, пос ле чего величину рН доводят до 6,4, После48 час плотно укомплектованные клетки составляют 6-8% общего объема, При помощи10%-ного инокулума инкубируют стеклянныйбродильный резервуар емкостью 20 л,. содер жащий ферментационну:о среду следующегосостава, г:Кукурузная жидкостьМука из соевых бобовЩн) 50Мд 507 Н,0ГлюкозаКН РО3645Ге 507 Н,0 8,5Хп 607 НО 42,5Мп 50 4 НдО 3,4Св 50 Ьн 0 2,8СОСЕ, ВН,О 1,7Н 0 ,Бо 1 л. Величину рН доводят до 7,8 при помощираствора едкого натра, После этого стерилизуют 50 мин при температуре 120 С, послечего рН доводят до 6,4. Ферментация проходит при 28 С в течение 200 час, При рН7,5 культуру снимают,Полученные по примерам 1 и 2 ферментаци.аниме жидкости гчищают следующим образом,Мицепий отфильтровывают и выбрасывают, рН фильтрата доводят до 2,0 при помощи 10%-ной соляной кислоты и экстрагируют три раза, применяя одинаковое количество этилацетата, Органический экстракт выпаривают в вакууме досуха при температуре35 С, Остаток (4 г из примера 1 и 1 гиз примера 2) растворяют в 0,005 М буфере фосфата натрия при рН 7;8, после чегоприбавляют йайО до конечной концентрации0,2%, Послеперемешивания в течение 30мин при комнатной температуре экстрагируют буферный раствор три раза, применяя одинаковое количество этилацетата, Соединенные органические экстракты выпаривают ввакууме досуха при 35 оС (первый экстрактэтипацетат), рН отсосанного буферного раствора доводят до 2;0 при помощи 10%-нойсоляной кислоты и экстрагируют три раза,применяя одинаковое количество этилацетата,Хл,единенные органические экстракты выпаоивают досуха прй - 35 оС (второй экстрактэтилацетата).Сухой порошок первого экстракта этилацетата (1,4 г из примера 1 и 4,2 г из примера 2) растворяют в хлороформе и хроматографируют на колонке силикагеля. В качествепервого главного продукта из колонки элюируют рифамицин й, который можно узнатьпо оранжево-коричневому цвету.Согласно тонкослойной хроматограмме спластинками силикагеля с хлороформом, метиповым спиртом в качестве системы растворителей (95;5) для рифамицина Й,ф,ЙФ0,59. Фракции, содержащие рифамицин Я,соединяют, выпаривают в вакууме досухапри 35 оС, растворяют в этилацетате и промывают 0,01 н соляной кислотой и затемводой. Органический экстракт концентрируюти рифамицин К при температуре 4 С выкристаллизовывают из раствора (600 мг по примеру 1 и 1,6 г по примеру 2), Второй экстракт этилацетата хроматографируют на колонке силикагеля, как и рифамицин . Сухойостаток (2,4 г по примеру 1 и 4,2 г попримеру 2) растворяют в хлороформе и наносят.на колонку силикагеля,Колонку элюируют при помощи смеси хлороформа и метилового спирта (98:2), Сначала получают рифамицин О, потом рифамиции Ы и рифамицин С, Все три компонента являютсяжелто-оранжевыми в промывном растворе иих можно определить тонкослойной хроматографией.Значения К составляют рафамицин0,63, рифамицин Р - 0,57, рифамицин Я -0,32, Фракции, содержащие рифамицины Ц,Р и Я соединяют, выпаривают в вакуумедосуха и кристаллпзуют из этипапетата. Попримеру 1 получают 80 г рифамипина Ц,9578014400 мг рифамицина Р и 280 мг рифамицина Ц, а по примеру 2 - 190, 900 и 750мг,При использовании штаммов Косагйатей 1 еггрпеа АТСС 31065 и 31066 получают аналогичные выходы рифамицинов О,Рий,формула изобретения 1, Способ получения рифамицина Р, Я 10Я.н О, о т л и ч а ю ш и й с я тем,чтоштамм Йцсагйа тейлор гапеа АТСС31064 (П;2), или Хосагйа пес 1 ЖеггалеаАТСС 31065 (ММ-6), или Иосагсйатей 1 еггалеь АТСС 31066 (М) вы кращивают в аэробных условиях при темпера 10туре 25-37 оС на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при рН 6,4-8,5, затем из ферментационной среды выделяют комплекс целевого продукта и разделяют его на отдельные компоненты Р, й К, и О.2, Способ по п,1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что, рифамицин выделяют из ферментационной среды экстракцией не смешиваюшимся с водой растворителем при рН ниже 5,3, Способпоп, 1,отлич ающий-. с я тем, что комплекс целевого продукта разделяют на отдельные компоненты хроматографией на колонке, Составитель С, МалютинаРедактор А, Бер Техред И. Гоксич Корректор С, ШекмарЗаказ 3254/55 Тираж 541 Подписное 0 НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 филиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4