Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью

Союз Советскнк Соцналнстнческн к Республнк(51) М. Кл. С 12 1) 9/14С 12 Э 13/00 Государственный комитет СССР ио лейлам изобретений и открытий(088,8) Опубликовано 150280 Бюллетень,% 6Дата опубликования описания 180280 ИностранцыГеорг Алберс-Шонберг (Швейцария),Ричард Уильям Бэрг, Томас Уильям МиллерОрмонд и ХимаН Воллик (США) 72) Авторы изобретен и Иностранная фирма Мерк Энд Ко, Инк) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВф ОБЛАДАЮШИХ АНТИПАРАЗИТАРНОЙ АКТИВНОСТЬЮспособу щих акти- микробиоИзобретение втолучения веще паразитарной а логическим пут тно ситсяв, обла ивностью В литературе не описаны способы получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью, путем мик робиологического синтеза. Согласно изобретению способ получения подобных веществ характеризуется тем, что штамм ЬЕ, Ер.ои Сев с(чЕ- ти 4(6 МК 2 8165 (АТТС 31267) выращивают на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли в аэробных условиях а последующим выделением из среды выращивания целевого продукта. Выращинание указанного штамма проводят при температуре 20-40 С, рН сре ды 6,0-7,5 в течение 1-8 дней на среде, содержащей 0,5-5% источников углерода и 0,2-6% источникон азота. Целевой продукт выделяют Фильтронанием среды выращивания зкстрагиронанием образовавшегося на Фильтре остатка - мицелия смешивающимися с водой органическими растворителями и затем экстрагирова вием остатка не смешивающимся с во 1 дой органическим растворителем.Вещества, описываемйе здесь подобщим наэванием С, получают выращиванием в контролируемых условияхранее не описанных штампов микроорганизмов 5 сгертоттнсев ачегттъсб 5,которые насчитывают до восьми различных родственных соединений,описыавемгх здесь под названиемСА 1 а, А 1 в, А 2 а, А 2 в, В)а, В 1 н,В 2 а и В 2 а. Все эти соединения обладают значительной антипараэитическойактивностью и могут быть полученыФерментацией и извлечены почти вчистом виде.По данным таксономических исследонанит. микроорганизм способны образовывать С-соединения, которые ф являются новым видом рода .1 гертотпчсеэназванного. 5 ттертотттмсеэ аегттйббьТакая. культура, выделенная из почвы,н коллекции культур Марка и К Инк,Роуй, Нью Джерси, была обозначенакак МА. Образец культуры, Поющий С, был депониронан н постоянной коллекции культур Отпела Ферментации исследовательского влиялаДепартамента сельского хозяйства "О США н Претории и получил порялк 1 оый3 л этогс хлороформного раствора хроматографируют на 2400 г силикагеля (Девидсон, сорт 62) н хлороформе.Колонку (,9,5 х 122 см) проявляют восемью пооциями по 3800 мл хлороформа (Фракции 1-3), затем восемью порциями по 3800 мл смеси хлороформ: метанол;1 (фракция 9-16) . Индивидуальные Фракции анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Кванта/Грамм 01 Г), пооявленные хлороформом: метанолом :19:1, Каждую из фракций 9-11, 12-13 и 14 выпаривают досуха и получают 6,63 г твердых веществ, содержащих СА компоненты,но фракциях 9-11 24,9 г твердых веществ, содержащих СВ компоненты,но фракциях 2-13 и 4,7 г твердых веществ,содержащих СВ-компоненты во фракции 14.Фракции 12-14 объединяют (29,62 г), растворяют в 100 мл хлористого мети лена и хроматографируют на 400 г силикагеля (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонку элюируют 1500 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол:1, 1500 мл смеси хло ристый метилен: 2-.пропанол:1, 2000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол:1 и 1000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол:1.2,56 г вещества, выделенного из элюа- Зр та объемом 5500 мл, и 5,09 г, выделенного из элюста объемом 6000- 6500 мл, растворяют в 25 мл хлористого метилена и хроматографируют на 60 г силикагеля в гексане. Собирают головные Фракции из 70 мл гексана и 100 мл смеси гексан: диэтиловый эфир:1 и затем колонку проявляют 600 мл смеси гексан: диэтиловый эфир:1;4, отбирая фракции по 20 мл и затем элю ируя 700 мл эфира и отбирая фракции по 100 мл. Из элюатов объемом 400- 600 мл получают 1,035 г твердых веществ, содержащих В 1-компоненты С; иэ объемов 600-1000 мл полу чают 0,881 г твердых веществ, содержащих смесь компонентов В 1,В 2= ЪС, и из объемов 1100-1500 мл получают 0,381 г тверях веществ, содержащих В 2-компоненты С, 50Смесь компонентов В 1 и В 2 затем растворяют н 4,2 мл смеси метанол: вода:4:1 и хроматографируют на Пора- силе С 18 (Бонданак 37-75 мкм в том же растворителе. Из обратнофазной колонки высокого давления (сначала элюируются более полярные компоненты) размером 1,2 м х 16 мм элюируют вещество со скоростью 800 мл/ч и отбирают фракции по 21, 3 мл, Присутствие компонентов Сподтверждается наблюдением УФ-поглощения фракций, СВ 2 несом 137 мг извле-" кают во фракциях 24-37 и СВ 1 весом 195,4 г но фракциях 51-70, Затем каждый образец отдельно хроматографируют на колонках, заполненных4 г силикагеля (Денидсон, сорт 62)в хлористом метилене. Колонкиэлюируют 35 мл смеси хлористый метилен: метанол:9:1. Последние 20 млэлюата из каждой колонки собирают,выпаривают досуха и получают 155,8 мгСВ 2 и 90 мг СВ 1.Затем 50 мл СВ 1 и 100 млСВ 2 храматографируют на препаратинных силикагеленых пластинках(Аналтак НР 254) извлекают гексаном,содержащим 12 изопропанола с последующим извлечением эфиром и получают почти чистые СВ 1 и СВ 2,П р и м е р 3. 50 мл среды,находящейся в колбе Эрленмэйера емкостью 25 мл, состава, нес.%:Лактоза 2,0Барда 1,5Автолизированные 0,5дрожжирН перед стерилизацией 7,0было инокулировано содержимым замороженной ампулы ягер 1 опвсеэ свегъъ 66 э МА 4848 и инкубировано вовращающемся взбалтывателе при 28 С втечение 24 ч при скорости вращения150 об/мин.10 мл этой Ферментационной средыиспользуют для инокуляции такой жесреды в двухлитровой колбе Эрленмейера. Ферментационная среда инкубировалась при 28 фС 24 ч при50 об/мин во вращающемся взбалтывателе.Все эти среды затем применяют дляинокулирования 467 л соеды в бродильном чане емкостью 756 л состава,вес.З:Лактоза 2,0Барда 1,5Автолизированные 0,5дрожжиПолигликоль 2000 мл,л. 0,32рН перед стерилизацией 7,0Ферментационную среду инкубируютпри 28 С 40 ч пропусканием воздуха(9 мз/мин) при перемешинании соскоростью 130 об/мин.230 л этой среды используют дляинокулирования находящейся н бродильном чане иэ нержавеющей стали емкостью 5760 л среды следующего состава,нес,%:Декстроз а 4,5,ПептонизированноемолокоУАнтолизиронанныедрожжи0,25Поли гликоль, мл/л 2,5рН перед стерилизацией 7,0Ферментацию продолжают 144 ч при2 б С пут ем пропуск ани я воздуха- 49 м/мм и перемешивании со скоростью вращения мещалки 120 об/мин.Ферментационную среду отфильтровывают, фильтровальный жмых мицелияпроминают 550 л воды и Аильтрат и40 П р и м е р 5. В колонку диамет- у ром 20 см загружают слой 34 кг активированного глинозема и затем слой 34 кг активированного угля в хлористом метилене. Остаток из предыдущего примера растворяют в хлористом метилене доводя объем до 34 л, зали/вают в колонку и элюируют 34 л, хлористого метилена и эти фракции отбрасывают, В колонку подают ЗЪ-ный раствор изопропанола в хлористом метилене (20,8 л изопропанола и 660 л тровальный жмых взмучивают в течение 1 ч с 500 л ацетона и отфильтровывают, Отфильтрованный жмых промывают 150 л ацетона и 40 л воды и по"лучают около 2000 л экстракта,Ферментацию и экстракцию повторяют в тех же количествах и получаютеще 2000 л ацетонового экстракта,который затем объединяют с первымэкстрактом и упаривают до 800 л спомощью концентрированной солянойкислоты; рН концентрата устанавливают 4,7 и добавляют 800 л хлористого метиленаОбъединенные растворители перемешивают 4 ч и слои разделяют. К водному слою добавляютеще 600 л хлористого метилена и пе-ремешивают 4 ч, Слои разделяют икаждый экстракт отдельно обрабатывают, Оба экстракта упаривают дообщего объема 60 л.П р и м е р 4, 60 л раствора; 20из предыдущего примера удариваютдосуха в вакууме для удаления остаточного хлористого метилена и к остатку3 раза добавляют по 60 л метанола.Конечный объем метанольного концентрата 36 л. Метанольный раствор выдерживают ночь и отФильтровывают. Фильтровальный жмых промывают 40 л свежего метанола и фильтраты и прорывныеводы объединяют, Затем в метанольный 30раствор добавляют 95 л этиленгликоляи 130 л гептана, Двухслойный растворпроьювают смесью 20 л этиленгликоля и б, 3 л метанола. Спустя 5 минпосле перемешивания,нижниР слойот- уделяют и объединяют с первым этиленгликоль-метаноловым экстрактом,К этому экстракту добавляют равныйобъем воды (около 150 л), содержа"щей 79 г соли на 1 л. Полученныйраствор экстрагируют 150 л эфираи перемешивают в течение 5 мин,Эфирный слой промывают 75 л воды(1/2 объема), перемешивают 5 мин ислои разделяют. Этот процесс повторяют еще 2 раза (промывная вода содержит 20 г соли на 1 л). Эфирныйслой упаривают в вакууме до минимального объема при температуременее 25 С, К остатку добавляют40 л хлористого метилена и раствор 50выпаривают досуха. Этот процессповторяют и конечный остаток концентрируют в вакууме досуха,хлористого метилена) и элюируют,отбирая Фракциил. Эти фракцииупаривают в вакууме на бане, нагретой до 60 С, до объема 20 л, Затемоснижают температуру бани до 45 С,экстракт выпаривают в вакууме досуха.Остаток растворяют в 10 ч хлористогометилена, 10 ч гексана и 1 ч метанола до конечного объема 15 л,Этот раствор загружают непосредственно в колонку с СефадексомН.П р и м е р 6. В колонку диаметром 30 см загружают 36 кг Сефадекса Ни промывают смесью хлористыйметилен: гексан: метанол:10:10:1.В колонку заливают .0,25 раствораСи элюируют со скоростью250 мл/мин, Отбирают две первыефракции по 20 л, которые отбрасывают и затем 20 Фракций также по20 л. Последнюю фракцию также выбра".ывают, Было найдено, что Фракции1-8 содержат С-соединения А- ифракции 9-10 В-соединения, 680 гэтого образца растворяют в 2 л хлористого метилена, загружают в 22-литровую трехгорловуй круглодонную колбуи добавляют 13,6 л метанола. Затемхлористый метилен отгоняют в вакууме,одновременно добавляя 13,6 л этилацетата. Скорость отгонки регулируют так, чтобы температура растворабыла не ниже 6 С. После добавления этилацетата раствор остываетпри 5 С 16 ч, Кристаллы отфильтровывают и промывают 1 л холодногоэтиленгликоля, Затем кристаллы сноварастворяют в 2 л хлористого метиленаи раствор загружают в 22-литровуютрехгорловую круглодонную колбу.Этупроцедуру повторяют дважды, В первыРраз применяют по 12,5 л метанолаи этиленгликоля и во второй,раз по13,5 л. Полученные в конце кристаллыпромывают 1 л холодного этиленгликоляи 1 л воды. Кристаллы растворяют в4 л воды и высушивают Фильтрованиемчерез сульфат натрия. Бензольный раствор концентрируют до 2 л, лиофилизируют и получают 341,2 г белого порошка,состоящего на 98 Ъ из С-В 1 и1% С-В 2,Маточные растворы после кристаллизаций объединяют и разбавляют 22 лводы. Водный раствор экстрагируют60 л толуола и снова 15 л толуола.Толуольный экстракт затем промывают48 л воды, Органическую Фазу Фильтруют для удаления остатков воды,упаривают и получают 336 г твердогоматериала, состоящего на 79изС-В 2 и на 16 из СВ 1-соединений.П р и м е р 7, В четырех колонках, заполненных Сефадексом ," Н,как в примере б, получают фракции1-8 и их объединяют, По данным,полученным с помощью жидкостной хро746 732 584 570 566 552 723 714 566 552 548,3131 584 746 760 728 580 ю 3406548,3136 456 Г 2886 305,2120 584 566,3265 598 552 566 442 442 456 442 456 442 456 309 323 291, 1962 323,2225 309,2070 305 291 291 305 291 305 261,139 261 261 261 275 275 275,1292 2571382 221,1527 193,1587 199, 1101 275 257 257 257 257 257 257 239 207 221 239, 1637 225 207 179,1429 221,1691 197,1542 193 197 211 199 199 199 199 199 199 199 матографии высокого давления, было найдено, что смесь содержит 252 г СА 2 а, 16 г А 2 В, 94 г А 1 а н 24 г А 1 в, Полученный продукт растворяют в смеси растворителей гексан: толуол: метанол :6:1:1 и загружают в колонку со Сефадексом Нтаких) же размеров, как в примере 2. Фракции собирают при скорости элюиронания 250 мл/мин, причем первые 20 л отбрасывают. Затем элюированием получают еще две 20-литровых первичных фракции, которые также отбрасывают и 50 фракций по 4 л, которые содержат С- ":.076 А-соединения. Было найдено, что фракции 3-8 содержат преимущественно .А 1 компоненты (40,2 г А 1 а и 6,7 г А 1 в) и Фракции 29-36 СА 2 соединения ( 117,2 г А 2 а и 7, 35 г А 2 в) . Фракции 9-28 содержали смесь С,А 1 и А 2 соединений.П р и м е р 8. Образец СВ 1 из примера 7 весом 150 г растворяют в 3 л смеси гексан:толуол:метанолс 3:1:1. Раствор пропускают через колонку с Сефадексом " Н,(таких же размеров, как в примере 6) Ь отбирают фракции со скоростью 250 мл/мин,Две первые 20-литроные фракции Отбирают и отбрасывают. Отбрасывают также головную фракцию объемом 10 л. Затем собирают 30 богатых Фракций объемом 2 л. Фракции 1-13 и 25-30 отбрасывают. Фракции 14-16 объединя ют, Они содержат 80 г преимущественно СВ 1 в.Фракции 22-24 объединяют. Они со держат 6,7 г преимущественно С Характеристики мас,В 1 в. Фракции 17-21 содержат смесьСВ 1 а и В 1 в,Фракции 17-21 объединяют, концентрируют и пропускают через колонку,заполненную Сефадексом ХН, пользуясь тем же растворителем, Трипервых фракции по 20 л отбрасывают.Затем отбирают следующие богатыеФракции: 5 Фракций по 2 л (фракции1-5) 20 фракций по 1 л (Фракции6-25) и 10 фракций по 2 л (фракции26-35) Фракции 1-5 отбрасывают,Фракции 16-21 содержат 13,5 гСВ 1 в и О, 4 г СВ 2 н, фракции22-26 содержат 44 г СВ 1 а и0,13 В 1 в, Фракции 27-30 содержат1 10,2 г В 1 в и 0,8 СВ 1 в.Отделение компонентов в от компонентов а производят с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. 30 мкл смеси СВ 1 а и А 1 н20 в абсолютном метаноле, содержащей30 мкл СА 1 в загружают н колонкудля жидкостной хроматографии высокогодавления, содержащую Сфери-Сорб5 мкм ОДЯ (фирма Спектра Физикс) н25 качестве насадки, Колонку элюируютсмесью метанол:вода85:15 соскоростью 15 мл/мин, Элюированиеконтролируют по УФ- поглощению элюатаи индивидуальные компоненты собирают3 О на выходе из УФ-прибора. Извлекают30 мкг Си анализируют в массспектрометре. Масс-спектр этого образца приведен во второй колонкетабл. 3,В табл,4 и 5 приводится антипаразитарная активность полученных соединений.с-спектральных пиковТаблица 3,044 Таблицаб-соеди- раженных осгь очище на,искуссых С енно Вид органиэма 137. 2852 4110, 1931761.,61 70 4 Ь895, -ООР 8 9 кЫк9 9 мФкВк м мк99 99 97 94 99 99 98 93 49 86 11 40 0,05 3 96 38 97 й897- 0060 0 3 вюО 3 35-ООХОЗ 0,1 3 99" .98 97 м 36 13 00 96 " 99 9 1487 46 46 53 0 83 88 0,05 3 0,025 3 84 46 1 72 69 11 523 0 31- Снижение количества паразитов по сравнению с контрольным образцом, вызванное обработкой Рс 0,05.0,01 с 0,001 соот- ветственно ентипаразитарная активность Спри испытании на искусственно зарааениом крупном рогатом скоте Таблица 5 вид организма Насвопс 1 цвр 1 асс 1 3 Г 1 сЬовтопду Вцв ахе 1 Соедииение Доза, Еолимг/кг чествоживот- ных ОвйегВад 1 а05 М 1 ОЯф Осворпадавтопцп га 61 а йцв ЗреЫйЗрелые Зрелый Ф,4 Зре 338 2 В 7 1198 55 5753 19 3 709 л 4 97 99 99" 99 В 1 100 9 4 97 100 77 99 е 99 961 аа 94 ф 69 100 100 100 83 99 х 99 49 9 4 0 100 Оф 95 99 99 99 94 92 82 бЭ 98 99" 2 Ь 92 95 1 ОО" Яффф+ 99 то 0 А 2 В 1 1 ОО г 9996 ф 813 14 100 93 Р О, О 0 1О, 01 О, 05 соответственно,Ф -Значительное сииаеиие эффективности по сравнению с эФфективностью при обработке другимн соединенияьк С, Ж 05. Ъ - Нарукное применение,Одра ба тку на про- ифводи- лн 0, 3 0,025 3 9897 Соорег 1 аопсорЬога 0 27 49 85оо с 1 ооЗаказ 9557/49 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 Формула изобретения1. Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоштамм 81 геровусев ачеттп 111 Иэ КВВ 28165 (АТТС 31267) выравивают на пи-.тательной среде, содержащей ассимилируеьые источники углерода, азотаи неорганические соли в аэробныхусловиях с последующим выделениемиз среды выращивания целевого продукта.102, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что выращивание указанного штамма микроорганизма проводятпрн температуре 20-40 С, рН среды6,0-7,5 в течение 1-8 дней,3, Способ по пп,1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что выращивание указанного штамма микроорганизма проводят на среде, содержащей 0,5- 5 источников углерода и 0,2-6,0 источников азота.4, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что целевой продукт выделяют путем фильтрования среды выращивания с последующим экстрагированием образовавшегося на фильтре остатка мицелия смешивающимися с водой органическими растворителями, выпариванием органического растворителя и экстрагированием остатка на смешивающимся с водой органическим растворителем.номер ИОВЕ 8165. Образец ИНВ 7. 8165был также депонирован в постояннойколлекции Американской коллекциитиповых культур в 123 п 1 ПарклаунДрайв Мериленд 20852 и получил порядковый номер АТСС 31, 267.МорФологические и культуральныехарактеристики следуюшие. МорФология:спорофоры образуют спирали в видебоковых ветвей воздушного мицелия.Спирали компактные, но делаютсяболее открытыми по мере старениякультуры. Споры цепочками не болеечем в 15 спор, обычно имеют сФерическую или овальную Форму (при увеличении в 970 раз). Спорообразованиенаблюдается в агаре с овсяной мукой, с глицерином- аспарагином, ссолями, крахмалом и с яичным альбумином, Поверхность спор гладкая.Агар с овсяной мукой: обратнаясторона - темно-коричневая.Воздушный мицелий; порошковыйкоричневато-серый (41,(обоз.начения" номера цвета взяты изСо 2 ог Кагтапч МвпеоМ, АЛЬ, 4 -Ф бсй 10 тСойе 1 пет О ЬИег)са, СЮсадо, ЭО,смешанный с белым.Растворимый пигмент: коричневыйЯапек Докс агар (сахароза-нитрат) .Вегетативный рост: плохой,бесцветный.Воздушный мицелий: скудный,серов атый .Растворимый пигмент: сероватокоричневый светлого тона.Яично-альбуминный агар: вегетативный рост умеренный, светло-серовато-желтовато-коричневый (В 9 е),смешанный с белым,РРастворимый пигмент:светло-серовато-коричневый.Глицерино-аспарагиновый агар, веге-. .тативный рост; обратная сторона желтовато-коричневая,Воздушный мицелий: порошковыйкоричневато-серый (411) , смешанный с белым.Растворимый пигмент: светлый,желтовато-коричневый.Неорганические соли - крахмал.Вегетативный рост: обратнаястоРона серовато-желтовато-коричневая.Воздушный мицелий: порошковый,светлый, коричневато-серый (41,по краям более темно-коричневатосерый (411 ).Растворимый пигмент: светложелтовато-коричневый.Агар с дрожжевым экстрактом-декстровой-соли,Вегетативный рост: обратная сторона темно-коричневая.Воздушный мицелий: умеренный,коричневато-белый. Растворимый пи гмент: коричневый,Агар с пентоно-железо-дрожжевымэкстрактом,Вегетативный рост: темно-коричневый.Воздушный мицелий: нет.Растворимый пигмент: от темнокоричневого до черного,Миланин: положительная реакция.Выделение Н Я; положительная рейакция,Агар с дрожжевым экстрактом мальтэкстрактом.Вегетативный рост; обратная сторона темно-коричневая.Воздушный мицелий: умеренный,коричневато-белый.Растворимый пигмент: коричневый.Питательный агар.Вегетативный рост: коричневый.Воздушный мицелий: скудный,20 серов атый.Растворимый пигмент: светло-коричневый,Питательный крахмальный агар. .Вегетативный рост: коричневый,25 Воздушный мицелий: скудный, серовато"белый. Растворимый пигмент.: светло-коричневый.ЗО Гидролиз крахмала: хороший.КартоФельная масса.Вегетативный рост: коричневый,Воздушный мицелий: коричневый,смешанный с серовато-белым,35 Сыворотка крови Лефлера.Вегетативный рост: сероватокоричневый,Воздушный мицелий: нет,Растворимый пигмент: некторое4 О потемнение среды.Разжижение: нет.Питательный тирозиновый агар.Вегетативный рост: обратная сторона от темно-коричневой до черной.45 Воздушный мицелий: скудный,сероватый.Растворимый пигмент: темно-коричневый,Разложение тирознна: нет,Усвоение углерода,Основная среда Придгема Готтлиба1 1 Ъ источника углерода + (+= рост, - = нет роста, в сравнениис контрольной без источника углерода) .Глюкоза + маннитон +Арабиноза + манноза +Пеллюлоза - ФаАиноза +Фруктоза + рамноза +Лактоза + сахароза +бО Мальтоэа + ксилоза +Иноэитол +Питательный желатиновый агар,Вегетативный рост: коричневый,Воздуиный мицелий; скудный,65 серовато-белый.20 Растворимый пигмент: светло-коричневый.Разжижение желатины: хорошее,Желатина (посев уколом).Вегетативный рост: коричневоекольцо. 5Воздушный мицелий: нет.Растворимый пигмент: зеленоватокоричневый,Разжижение желатины: полное.Агар-снятое молоко.10Вегетативный рост: темно-корич"невый,Воздушный мицелий: нет.Растворимый пигмент: темно-коричневый,Гидролиз казеина: хороший.Лакмусовое молоко,Вегетативный рост: темно-коричневое кольцо роста.Воздушный мицелий: нет.11 вет - темно-коричневый.Коагуляция и/или пептонизация:полная, делается щелочной (рН 8,1).Снятое молоко.Вегетативный рост: темно-коричне" .вое кольцо роста. 25Воздушный мицелий; нет.Растворимый пигмент: темно-коричневый,Коагуляция и/или пептонизация:полная пептонизация, делается щелоч Оным (рН 8).Температура: (агар с дрожжевым экс"трактом + соли):28 С - хороший вегетативный рости воздушный мицелий, 3537 фС - хороший вегетативный рост;и воздушный мицелий,50 С - роста нет.Потребность в кислороде: (культурауколом в агаре с дрожжевым экстрактом + соли) .Аэробная культура,Все определения производилисьчерез три недели при 28 С , еслиМе оговорено иначе. Значения рНвсех сред почти нейтральные (6,8-7,2),45При тщательном сравнении этих. данных с опубликованными описаниями,включая Руководство по определенной бактериологии Беркея (8 издание)известных микроорганизмов, обнару цживаются значительные различия,указывающие,что данный микроорганизм.должен бить классифицирован как новыйвид, На этом основании он был назв аи 5(гер 1 отсе 5 очегти(415, 55С-соединения получают приферментапии подходящей водной питательной среди штаммом Ргеротчсеь смегщМ 1 в описываемых далее условиях:водные среди, применяемые для получения многих антибиотиков, являются также пригодными для данногопроцесса получения С-соединений.Такие питательние среды содержатчсточннки углерода н азота, ассимилируемые микрооргачизмами и неболь 20,0 15,0 10, 04,0 .0,5 2,5 0,1 0,01 0,01 Кукурузная мука, гСоевая мука,гБарда, гЦитрат натрия, гСаСЗ 2 Н О, гПолигликоль Р 2000,млМСО,7 Н О, гСаС 1 6 Н О, гРея 04 7 НО/ гДистиллированнаявода, мл рН 6,1000 Среда В Р а ст в ори мий кр а х мал, г /.идкость от замп ки кукурузы, гПерелоза, г 20,0 15,0 5,0 шие количества неорганических солеР.ГКроме того, ферментационные средымогут содержать следы металлов,необходимых для роста микроорганизма. Они обычно присутствуют в видекомплексных соединений источниковуглерода и азота, применяеых в качестве источника питания, но их можно добавлять к среде отдельно,Такие углеводы как сахар, например декстроза, сахароза, мальтоза,лактоза, декстран, церелоза, и т.п,и крахмалы являются хорошими источниками ассимилируемого микроорганизмами углерода в питательных средах.Количество источника углерода, применяемого в среде, частично зависитот количеств других компонентовсреды и обычно составляет 0,5-5 вес.йот количества средыи считается достаточным. Источники углерода можноприменять отдельно,или их можнокомбинировать в среды с другими ком"понентами,При образовании С-соединенийлегко ассимилируемых штаммом 51 герогосеэ аде.гтйОбэ применяют такие различные источники азота, как дрожжевые гидролизаты, дрожжевые автоли-заты, соевая мука, гидролизаты казеина, дрожжевые экстракты, жйдкостидля замочки кукурузы, кукурузнаябарда, мука хлопковых семян, мясныеэкстракты и т,п. Можно применятьили один источник, азота, или в комбинации с другими соединениями вколичестве 0,2-6 вес.% среды.Из питательных неорганическихсолей, которые можно вводить в культуральные среды, можно назвать обычные соли, способные давать ионЫ Натрия, калия, магния, аммония,кальция, фосфата, сульфата, хлорида, карбоната и т.п. Вводятся в поеду такжеследы таких металлов, как кобальт,марганец, железо и т,п. Далее приведены примеры сред, пригопных плявыращивания штаммов Югероючсеъ свегпъ 1155 с целью получения ГсоединенийСреда А.(Ардамин рН ФирмыИст Продактс Инк,П ат ерсон )БаСМ, гКС 3 гРеЯО МН) ЯО 4 6 Н 20,МсСЗ 6 НаО, гСаС 2 2 НО, гДистиллированнаявода, мл рН 7,4 Ферментацию с применением микроорганизмов, образующих С-соединения,можно проводить при 20-40 С.Для получения оптимальных результатов наиболее целесообразно проводить эти ферментации при температурах 24-30 С. Наиболее предпочтительны температуры 27-28 С. рН питательной среды, пригодной для получения Ссоединений, можно менять в пределах 45 5,0-9,0 предпочтительно 6,0-7,5,Ферментации в небольших количествах удобно проводить в колбе в стерильных условиях, заражая питательную среду спорами или негетатин ними клетками штамма БО.ер(отмсез ачет-, щМь образующего С-соединения Колбу затыкают натой и выдерживают при постоянной температуре 28 фС и нэбалтывании в течение 3-10 дней. у При работе с большими количествами ферментацию рекомендуется проводить в сосуде, снабженном мешалкой и устройством для аэрирования питательной среди. Питательную среду готовят в сосуде, стерилизуют и затем заряжают источником вегетативного клеточного материала штамма Ягеропюсеэ очет-тч 6 Ив образую его С- соединения. Ферментацню продолжают 1-8 дней при перемешивачии и/или аэриронании питательной среды притемпературе 24-37 С, скорости перемешивания 95-125 об/мин и при подачевоздуха 1,8-18 м/мин.Получаемые по изобретению новыевещества, называемые здесь Свеществами, находятся по окончанииферментации главным образом н мицелиии могут быть извлечены и отделены,как описано выше. Выделяют четыреглавных и четыре второстепенных компонента Сб-соединениг, образуемыхЯгеропюсеэ смегпъ 66 в . Идентифицировано восемь различных соединений С, А 1 а, А 1 в, А 2 а, А 2 в, В 1 а,В 1 в, Ь 2 а, В 2 в, Главные компонентыобозначены )буквой а, второстепенные буквой в. Структурныеразличия между соединениями а и вдолжны быть одинаковыми для каждойиз четырех пар,Как и следовало ожидать, дажеглавные С-соединения не образуются в одинаковых количествах приописанных здесь условиях ферментации. Так, А 1 соединения составляют20-30 вес.Ъ от общего количества получающегося комплекса С, соединения А 2 составляют 1-20 вес.Ъ, соединения В 1 и В 2 каждое 25-35. Весовое соотношение ряда соединенийа к ряду соединений вф равно85-15 - 99:1.Отделение соединений Сотвсей Ферментационной массы и извлечение индивидуальных компонентов .производится экстракцией растнорителем и хроматограбнческим фракциониронанием различными хроматографическими методами и с различнымисистемами растворителей,С-соединения слабо растворяютсяв воде и хорошо н органическихрастворителях. Это свойство используют для извлечения их из ферментационной среды. Так, по одному способу извлечения всю ферментацион. ную массу отфильтровывают и водныйфильтрат выбрасывают. Затем отжатыйвлажный фильтрональный остаток мицелия экстрагируют подходящим растворителем. Хотя и можно применять любойорганический растноритель, лучшеприменять растворитель, смешинаюшийся с водой, например ацетон, метанол,этанол и т.д. Для достижения макси.мального извлечения рекомендуетсямногократная зкстракция. Растворителем извлекаются активные компонентыС, а также вещества, не обладающие антипаразитической активностьюсоединения С.Если растворитель смешивается сводой, то воду также удаляют из влажного мицелия.Экстрагиронанный мицелийможно отбросить. Экстракты упарннаотдля удаления органического растворителя и экстракцию повторяют несколько раз с другим растворителем. Если10 716524 при первой экстракции применяют. сЛГ=1шивающийся с водой растворитель,то при второй экстракции предпочтительнее применять не смешивающийся с водой растворитель, напримерхлороформ, хлористый метилен, четыреххлористый углерод, этилацетат,метилэтилкетон, метилизобутилкетони т.п. Полученные экстракты высушивают и концентрируют обычными методамиПолучают остатки, содержащиеС-соединения с примесямидругихсоединений. Затем эту фракцию хроматографируют для отделения активных. С-соединений от прочегоматериала и также для выделения индивидуальчых С-соадинений. Хроматографируют на колонкес применением таких сред, как сили кагель, окись алюминия, гели декстрана и т.п. и элюирование производятили различными растворителями и/иликомбинацией двух или более растворив А А 2 Молекул формула С.Н,О,С 4, но С,Н О СН 1 и ль, 307) Еод примеси соединений ряда в. Ря и в различаются только числом низкоалкильном заместителе и разница не связана с хромобор Ультрафиолетовое поглошение в вую очередь характеризует сте и природу ненасыщенности в со нии, Оптические вращения опреименяя стандартные методы и-СН в. та м. еньдинееляит поляУльтрафиолетовый спектр (28;700,4, 458) Ультрафиолетовые спектральные данные были получены с помошью ульФиолетового спектрометра Кери,ах в модель 15 в метанольных р аствооах кварцевых ячейках, плошадью 1 см. Хотя Ультрафиолетовое поглощение представлено как поглощение рядапо глошеа, фактически оно является по нием соединений ряда а, д рсо еркаких телей, взятых в различных соотношениях. жидкостную хроматографию применяют для открытия С-соединенийи жидкостнуюхроматографию высокогодавления можно применять для выделения очищенных фракций, содержащиходно или более соединении. Аналогичнохраматографию в тонком слое можноприменять для обнаружения и выделенияиндивидуальных С-соединениР. Присутствие активных С-соединенийопределяется испытанием различныххроматографических фракций на антипаразитическую активность и такжеспектральными характеристиками этихсоединений,Спектральные и другие физико-химические характеристики индивидуальных С-соединений приведены втабл.1, Эти соединения хорошо растворимы в больщинстве обычных органи ческих растворителей иобладаютминимальной растворимостью в воде.Т а б л и ц а 1(с) дается как количество соединения в данном растворителе, выраженное в процентах,. Данные ЯМР-спектра 13 С для СА 1 а, А 2 а: В 1 а и В 2 в приведены в табл,2. Спектры получены с помоцью спектрометра ядерного магнитного резонанса. Вариант модели СЕТв дейтерированном хлороформном растворителе при 13,8 15,1 . 17,7 применении тетраметилснлана в каче "тве внутреннего стандарта, Обьемраствора и концентрации образцовуказаны в кажцоч случае с последующими химическими сдвигами относительно тетраметилсилана для каждого соединения, данными в частях на миллион.Химические сдвиги даются для отдельного атома углерода, если не оговорено иначе, в скобках после химическогосдрига,(2 С) 80, 5120, 4 124, 8 79,4 73,3,117,7,173,5 76,1 99,7,(2 С) 135,7 )38,0 118,0 139,8 НО имент змере ся, ч иметь мулу ьны слевает прокситолько я укабутил и оксис 40 Инди дяшие в поиводя ти ойная связь ропил ая свя ути а ПропилБутилПропил О вяз В 1 н вязь утил 2 пил Н 2 в 67 р 3677 (2 СО) Характеристики масс-спектральныХ пиков восьми С-соединений приво, - дятся в табл.З, В первой строке таб- щ лицы представлено отношение массы к ,заРяду, (м/е) молекулярного иона каждого соответствующего соединения и остальные циАры дают отношение массы: к заряду главных фрагментов каждого соединения. Отношения масс к заряду находяшихся в одном горизонтальном ряду, указывают аналогичные фрагмен,ты каждого соединения.,Основываясь на экспер данных, исследованиях и и описанных здесь, считает С-соединения должны дуюшую структурную фор где Н- ) -1-олендрозил- -1-олеандрозид структуРы и где пунктирная линия указы тую или двойную связь; й - группа, которая присутствует тбгда, когда пунктирная лини зывает на простую связь, Н или пропил и й -метоксн- илзгруппа,дуальные соединения, вхту структурную Формулу,я ниже:Новые соединенияполученные поизобретению, имеют значительнуюпаразитицидную активность, как антигельминты, инсектициды и акарициды,1 ля животных и в сельском хозяйстве,Как готовые препараты эти соединения можно назначить внутрь, например в виде капсуль, больших пилюльили таблеток в виде жидких обильных доз антигельминтов для млекопитающих, Такие .отдельные дозы могут широко изменяться по общему весу исодержанию антипаразитического агентав зависимости от таких факторов, как паразит, подлежащий уничтожению, силы и типа инфекции и веса тела животного,Применять предлагаемые соединения можно или как очищенные индивидуальные С-компоненты, или в видепримесей двух или трех индивидуальных компонентов, поэтому нет необходимости тщательно разделять различные С-соединения, полученные после очистки ферментационной среды, Обычно для предупреждения переносимых паразитами забОлеваний приМеняЮт смесь, содержащую два или более Сб-соединений, но без примесей других соединений. Такая смесь .обычно содержит С-соединения в произвольных соотношениях, но все они обладают значительной активностью. Антипаразитическая активность может быть точно определена. В частности, необяз тельно отделять компоненты в от родственного компонента в. Такие соединения отличаются только длиной 25-ой боновой цепи. Разделение таких родственных соединений обы юо не производится, так как соединениевприсутствует лишь в виде примеси.С-соединения при добавлении к корму животных можно использовать в виде жмыхов мицелия Аерментацион 2535 405055бО Соедин ени я, в ксторнх Я 1 - бутил (соединения рядаа ) и соответствующие соединения, в которых Вв пропил (соединения рядав ) ведут себя одинаково в большинстве процессов извлечения, например при экстракции растворителем, В каждой паре соединений а и в соединение 1 1а находится в больщем количестве и обычно составляет 85-99 смеси соединений аив . Присутствие пропиловых соединений подтверждается- 10 ,масс-спектрами соединений, где пики представляют собой Фрагменты, содержащие бутильную группу, имеют парные пики с массой на 14 единиц (или одну -СН) меньше. В дополнение следует отметить, что для отделения компонентов В 1 в от компонентов А 1 а применяли жидкостную хроматогоайию высокогодавления и масс-спектр такого А 1 в-соединеия подтверждался масс-спектромет рией высокого разрешения (см.табл,3)ной среды. Поскольку мицелий достаточно активный и уровень активности мицелия можно определить, его можно добавлять непосредственно к корму животныхПример 1.Среда 1Томатная паста 20 г/лДрожжи 10 г/лКрахмал модифицированный,20 г/лСоСЙд6 Н ОПолигликоль 2000Дистиллированнаявода рН 7,2-7,4 5 г/лО, 321 мл/лДостаточное количество Стадия А, .50 мл среды 1, помещенной в колбуЭрленмайера емкостью 250 мл, инокулируют замороженной ампулой 5 йер 1 оп- сез оче тнЯЬ МА 4680, Колбу инкубируют при 28 фС при вращении взбалтывателя со скоростью 160 об/мин покругу диаметром 50 мм в течение 24 ч.Стадия В.500 мл среды 1, содержащейся вдвухлитровой колбе Эрленмайера, инокулируют 10 мл содержимого колбы стадии А. Среду инкубируют при 28 Спри вращении вэбалтывателясо скоросстью 150 об/мин по кругу диаметром50 мм в течение 24 ч,Стадия С.В бродильный чан иэ нержавеющейстали емкостью 189 л заливают 160 лсреды 2 и добавляют 500 мл посевногоматериала, полученного на стадии В.оЧан инкубируют при 28 С при вращающейся со скоростью 150 об/мин мешалкев течение 24 и скоростью аэрирования 2,7 м/мин.Среда 2,Декстроза, г/л 1Крахмал кукурузный, 10г/лМясной экстракт, г/л 3. Автолизированныедрожжи, г/лМАМБО 7 Н О, г/л , 0,05Иа НРО 4, г/л 0,10К РО , г/л О, 182СаСО, г/л 0,5Дистиллированная Достаточноевода рН 7,0-7,2 количествоСтадия Д.В бродильный чан из нержавеющейстали емкостью 756 л заливают 457 лсреды б и добавляют 43 л материалапрививки, полученного по стадии С.Чан инкубировади при 28 С при перемешивании и скорости вращения мешалки114 об/мин и аэрированич при скорости потока воздуха - 9 м /мин.зСтадия 3.Крахмал продажный,СРС, гМодиФицированныйАвтолизированныедрожжи (Фирмы Истпродактс инк), гСоС 3 6 Н О, мгДистиллированнаявода, мл рН 7,3 5,0 501000 Фракцию СВ 1 хроматограФируютна 2 силикагелевых пластинках (какуказано выше) гексаном, содержащим15 изопропанола и получают 55 млпочти чистого СВ 1. ЯМР- спектрэтого образца приведен в табл,2,П р и м е р 2. Ферментаиию, описанную в примере 1, повторяют дважды и обе средн объединяют, Ферментационную среду обрабатнвают так, какописано в примере 2, получая 3, 3 лпервоначального хлороФормпого экстракта, которнй содержит 60 мг/л вес хтвердых веществ и по ланпнм хро латографии в тонком олсон 0,5.сокл;нений С,Стадия Е.По окончании этого всю культуральную среду отфильтровывают и оставшийся на фильтре жмых, содержащий С,соединения, промывают водой. Затемего взмучивают в 120 л ацетона втечение 30 мин, отфильтровывают ипромывают 30 л ацетона. Ацетоновыеэкстракты объединяют и выпаривают припониженном давлении до объема 40 л. 15Разбавленной соляной кислотой рНконцентрата доводят до 4,0. Концентратэкстрагируют 3 раза произвольнымиколичествами хлороформа. Хлороформные экстракты высушивают пропускани- Эемчерез слой инфузорной земли (СаперСел). Объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлениидо 4 л. Хлороформный концентрат филь,труют и загружают в колонку, заполненную 2,9 кг силикагеля в хлороформе. Колонку элюируют хлороформом,собирая восемь Фракций по 3,5 л)осаждая. Затем колонку элюируют смесью:хлороформ: метанол-(49:1), собираяеще восемь фракций по 3,5 л (Фракции 9-16), Фракцию 3 упаривают досуха и получают 76 г маслянистого вещества, содержащего главным образомСб-соединения.97 этого продукта растворяют в685 мл хлористого метилена и хроматографируют на 600 г кремнекислоты, Колонку (диаметр 7,3 мм,длинаЗбсм) проявляют 7,5 л смеси хлористого метилена и бензола (7:3) и затем 402,26 л смеси хлористый метилен бенэол:3 с добавкой 5 иэопропанола.Фракция, элюированная смесью хлористого метилена с бензолом с добавкой 5изопропанола,имеет четко окрашенную 45полосу и содержит Фактически весьматериал С, как это было бпределено хроматографией в тонком слое(см.пример 5), Эту фракцию объемом(500 мл) упаривают и снова хрома Отографируют на 105 г кремнекислоты(диаметр колонки 3,7 см, длина18 см) в хлористом метилене, Колонку проявляют тремя порциями хлористого метилена по 100 мл, содержащего 554,10 и 20 эфира. )альнейшее элюирование хлористым метиленом с содержанием 20 эфира дает 2 окрашенных полосы. Фракция между двумя полосамифактически содержит весь С-ма 60териал, как это установлено с помощьюхроматографии в тонк эм слое,Фракцию, содержадо С, хроматографируют на 59 г коемнекислоты;(диаметр колонки 3,7 см, длина 11 см)в хлористом могилеве. Колонку промывают хлористым метиленом, содержащим10 эфира, В начале элюирования отбирают фракции по 70 мл и затем отбирают 26 фракций по 5-6 мл, Фракции3-26 объединяют и получают 1,35 гматериала, его анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевыепластинки Аналтак С Г 254, проявленные хлористым метиленом, содержащим5 изопропанола, Веществом, имеющимй 1 0,28 является СА 1.Колонку элюируют хлористым метиленом, содержащим 20 эфира (200 мл),затем хлористым метиленом, содержащим 50 эфира (800 мл), Получаютнебольшое количество смеси СА 1и А 2 и все остальное количествоСА 2. Вес СА 2 800 мг,При дальнейшем элюировании хлористым метиленом, содержащим 5 изопропанола, получают 135 мг СВ 1,Разделение производят по ультрафиолетовому поглощению элюата, СВ 1 иА 2 имеют очень близкие величины Я 1на силикагелевых пластинках хрома-.тограмм в тонком слое (аналтак С Г254) и хлористом метилене с 5 изопропанола. Рднако оба компонентаясно различимы на тех же пластинках,проявленннх гексаном, содержащим10 изопропанола.Всю Фракцию СА 1 наносят на14 силикагелевнх пластйнок (аналтак СГ 254, 20 х 20 см, толщина 500 мкм) . Пластинки проявляют гексаном с 10%изопропанола. Полосу, содержащуюСА 1, удаляют с пластинок, экстрагируют эфиром и снова наносят наб пластинок и 5 раз проявляют гексаном, содержащим 5 изопропанола. СА 1 удаляют с пластинок, снова хроматографируют, проявляют чистым эфиром и получают 27 П мг почти чистого СА 1. ИК- и ЯМп-спектры этого образца приведены в табл.2,Фракцию СА 2 хроматограФируют на 10 силикагелевых пластинках (аналтак НГ 254), проявляют 5 раз ,гексаном, содержащим 15 изопропанола и получают 265 мг почти чистого СА 2, ИК- и ЯМР-спектры образца этого вещества приведены в табл.2.