Способ выделения орготеина

цйЯ. М-."- б котена4О П И А Н И Е ,51 аб 95 Своз Советских Социалистических Республик(32) 07.12,7 (33) США Государственный комнтетСовета Мнннстроа СССРно делам нзобретеннйи открытий 31) 609 публиковано 05. ата опубликова: 615.361.ЗЕ088.8) ИностранцыГубер, Марк Гари Сайфер (США) Хьюнг Чоу (Великобритания) лика Хедвиг Хьюбнер (фРГ) Авторыизобретен ольфган Сильв и Анд Иностранная Дйагностик Дэит(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОРГОТЕИНА тся к способам про-Изобретение относизводства лекарственнИзвестен способ ппутем хроматографичесния на ионообменныхжашего материала.11 елью настояшегоповышение выхода цел х препаратов,лучения орготеинкого фракциони готеинсодер- а иэобретени евого прод ляется а б Для этого адсорбцию орготеинсодержашего материала осуществляют на диэтиламиноэтил- или триэтиламиноэтил- целлюлозе при рН 6,0, элюируют буферным раствором с ионной силой не более 0,02 М с последующей десорбцией целевого продукт градиентным буферным раствором с ионной силой 0,02-0,03 М с отделением фракций элюата с оптической плотностью А или А, содержащих двухвалентные ионы меди и/или цинка,Для выделения орготеина иэ тканей животных берут печень, Можно брать также почки, сердце, мозг, селезенку, внутренности, мышцы, панцири, шейные железки, лег- кие, язык, тимус и поджелудочную железу. ачестве исходного материала использукровь,Рекомендуются животные, ткани которых могут быть использованы в качестве источника смесей белков, содержащих орготеин и растворимых в буферных растворах, - быки, свиньи, лошади, а иэ птицы- цыплята, Наиболее пригодными являются растворимые белки иэ тканей быков,Исходную смесь, содержащую растворимые в буферном растворе и включающие орготеин белки, готовят путем тшательного перемешивания тканей животного с выбранным водным экстрагентом.Для выделения растворимых белков иэ нерастворимых ткани тщательно измельча ют, например, в мясорубке, перемешивают с экстрагируюшей жидкостью в быстроходном смесителе.Экстрагенты и ткани животного берут в объемном соотношении между ними в интервале примерно 2,3:1 и 2,8:1.В качестве экстрагента можно испо;:; зовать воду, смесь воды и смешивающегося с ней органического растворителя, напри мер, ацетонаметанола, этанола, буферныйраствор с ионной силой, например 0,01-0,05 М, предпочтительно 0,02-0,03 М.Выделение рекомендуют вести при сла-бо щелочной величине рН, находящейся впределах между 7 и 9, предпочтительномежду 7,5 и 7,8.Для повышения ионной силы экстраген-та в него вводят хлористый калий, хлори-;стый натрий, сульфат двухвалентного мар-,ганца или другие незабуфериваюшие соли.Для повышения избирательности буферного раствора в него добавляют растворимыесахариды, например глюкозу, сахарозу и,т,д что облегчает процесс экстракции.Смесь суспендированных частиц тКании водного экстракта разделяют путем фильтрования под давлением или в вакууме, илипутем центрифугирования.Для осуществления способа пригоднырастворимые белки красных кровяных клеток, содержащие орготеин и имеющие изо-.электрическую точку, отличающуюся отиэоэлектрической точки ангидразы угольной кислоты, присутствующей в смеси, поменьшей мере, на одну единицу рН. Предпочтительны растворимые белки красныхкровяных клеток быков, цыплят и человека,Красные кровяные клетки отделяют отплазмы крови путем центрифугирования,выделенные клетки промывают и повторяют центрифугирование, удаляя остаточнуюплазму,Обработанные таким образом клеткиподвергают лизису (разрушению клеток)под действием ультразвука,После удаления нерастворимых компонентов клеток, на долю которых приходится около 2 % по весу консервированныхклеток, раствор растворимых белков изподвергшихся лизису красных кровяныхклеток контактируют с хроматографическим адсорбентом, для того чтобы произошла адсорбция орготеина,Для того чтобы уменьшить влияние растворенных солей на способность орготеина к адсорбированию на хромвтографическом адсорбенте, рекомендуют поддерживать ионную силу исходного раствора на уровне от 0,001 до 0,005 М,По предлагаемому способу в качестве вдсорбентов используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ), триэтиламиноэтил-целлюлозу (ТЭАЭ), диэтиламиноэтил-сефв-, декс и ЯАЕ-сефадекс. Такие смолы име- ют адсорбционную емкость, составляющую примерно от 1,0 до 5 миллиэквивалента . нв грамм. ф3595гОрготеин выделяют иэ ионообменмвающей смолы методом избирательного элю-,чрованияСначала вымывают иэ колонки весь гемоглобин и другие не подвергшиеся адсорбции белки, а затем осуществляют избирательное элюирование орготеина из колонкии выделение его из той фракции элюата, которая содержит чистый орготеин,Удаление гемоглобина, миоглобина и других не адсорбировавшихся белков осуществляют путем промывания колонки водным элюентом, величина рН которого сбставляет примерно 6, или же фосфатным буферным растПосле удаления из колонки гемоглобинаи других, не подвергшихся адсорбции,белков, проводят избирательное элюированиеорготеина иэ колонки при помощи водногоэлюента, величина рН которого составляетпримерно 6, например находится в пределах между 5,7 и 6,3 и с таким варьированием ионной силы, чтобы элюирование вдсорбировавшихся белков происходило последовательно. Для этого используют буферныйрвствор,с ионйой силой около 0,001-0,005 Мдля элюирования легко элюирующихся белковых смесей, примерно 0,02-0,03 М дляэлюирования орготеинв и примерно 0,1 -2,0 М для освобождения колонки от остаточ 30ых белковых примесей.Определение фракции элюата, содержащей чистый орготеин, осуществляют путемизмерения оптической плотности элювта при)длине волны 280 ммк и 265 ммк,Начало отбора фракции элюата, содержащей существенные количества меди и цинка считают началом отбора фракции орготе 40ина, если в качестве исходного материалаприменяют растворимые белки тканей животных,Окончание отбора фракции орготеина определяют по резкому снижению содержания4 Гмеди и цинка и по резкому повышению оп-,тической плотности при длине волны 265или 280 ммк.Чистый орготеин может быть полученгермической обработкой предварительно очибОщенного на ДЭАЭ-целлюлозе орготеина,Орготеин экстра-чистоты получают извыделенного на ДЭАЭ целлюлозе орготеина путем последующей термической обработки части элюатв, содержащего орготеин, ионы 5 двухввлентной меди и ионы двухвалентногоцинка, например, при температуре 65-75 С в течение 15 мин, при величине рН 5,8 с последующим центрифугированием и диалиэом, путем повторной ионообмениваюшеи, 60;хромвтографической очистки на ДЭАЭ-цел 513595люлоэе или путем обработки протеолитичео-ким энэимомП р и.м е р 1. Орготеин иэ печени быка, Печень быка (212 г) нарезают на полоски шириной 2 см, удаляют соединительную ткань и кровеносные сосуды, промывают для удаления крови и гомогенизируют при максимальной скорости в быстроходном смесителе, используя на 1 кг печени 3,8 мл трис-глицинового с НС 8 буферного раствора с рН 7, 5,03 М по свхароэе и 0,05 Мо по НС 8. Затем центрифугируют при 0 С 60 мин. Центрифугат отделяют, производят диалиэ верхнего слоя жидкости с использованием фосфатного (0,005 М) буферного раствора с величиной рН, равной 6,0. Затем снова центрифугируют и фильтруют через микропористый фильтр ("версанор") для получения прозрачного раствора.фильтрвт вносят непосредственно в ионообмениваюшую колонку диэтилвминоэтил-целлюлозы (около 40 г, 2,5 см х 40 см), Колонку промывают (скорость течения 200 мл/час) при помоши 1 л фосфатного буферного раствора (0,005 М, рН 6,0) и затем четырьмя литрами того же буферного раствора, содержащего хлористый натрий в количестве постоянно и постепенно возрастающем.в интервале от 0 до 7,5 х 10 М, при скорости течения 200 мл/час. При этом производят непрерывное измерение оптической плотности Аи А элюата и постоянный контроль содержайия меди и цинка с использованием метода адсорбционной спектрофотометрии.После. отбора 1 л элюата, не содержащего хлористый натрий, собирают 750 мл элюатв, содержащего постепенно возрастающие количества хлористого натрия или хлористого калия, в этот момент времени молярность постепенно достигает величины 0,018 М, величины оптической плотности А и А 0 уменьшаются до низких величин а содержание меди и цинка резко возрастает, После этого собирают элюат и отбор его ведут до тех пор, пока содержание меди снова снизится до минимального, в молярность достигает величины около 2,8 х 10 2 М (550 мл элювта,который содержит 240 мг орготеинв высокой стьпени чистоты), Чем меньше фракция, отбираемая из этой порции элюата, тем больше степень чистоты присутствующего в ней и выделяемого из него орготеина и тем меньше его выход.Орготеин наивысшей степени чистоты присутствует в элюате, ионная сила которого составляет примерно 0,022 М (при общем объеме элюата 950 мл). В этой гочке кривые поглощения меди и цинка имею,ют максимумы,Дивлиэ фракции, находящейся в интервале объема отбирвемого элюатв от "750 до1300 мл, производимый с использованиемводы до снижения проводимости до 004 М,фильтрование через микропористый фильтр,и лиофилизвция, проводимая в стерильныхсловиях, предпочтительно после смешения,1 римерно вдвое большим весовым количеством сахарозы (из расчета нв орготеин), приводят к получению выделенного полностьюактивного, неантигенного, пригодного дляинъекций орготеинв, качество которого сравнимо с качеством того же препарата, изготавливаемого в промышленности для исползования в ветеринарии.Промывание колонки для удаления не адсорбированных или слабо адсорбировянныхбелков до элюирования орготеииа осуществляют при постоянной ионной силе, со сту-пенчатым повышением ионной силы или принепрерывном повышении ионной силы, например путем элюирования колонки буфернымраствором с ионной силой, на одящимся винтервале между, примерно, 0,012 М и, примерно, 0,015 М, производимым до тех пор,пока величины оптической плотности А 6,и А не снизятся до минилальных значений, с последующим элюироввнием орготеина при постоянной величине ионной силы,при ступенчатом повышении ионной силы,илн при непрерывном повышении ионной силы в пределах между, примерно, 0,018 Ми, примерно, 0,028 М,ЗЬЗатем колонку освобождают от остаточных вдсорбироввнных белков путем повышения ионной силы элюента до величины окьло 0,1 М или выше.При применении способа, описанного впримере 1, сходные результаты были получены при использовании в качестве вдсорбентов ТЭАЭ-целлюлозы и имеющей поперечные связи декстрановой смолы, содержащей диэтилвминоэтильные группы,При применении способа, описышого впримере 1, сходные результаты получены, когда в качестве исходного материала применяют растворимые белки, выделенные соответственно, из тканей бычьего мозга, почек, селезенки, легких, семенников, поджелудочной железы, тимуса, мышц и тех же тканей свиней, лошадей, овец и цыплят.П р и м е р 2, Орготеин из бычьейкрови. Свежую бычью кровь (870 мл) собирают в 38%-ном растворе цитратв иятрия (0,5 объем/объем). Цоитрифугирунзт при скорости врашения центрифуги, соэч ветстпую513595 ф ормула изобретения Составитель Т. СеребренниковаРедактор В. Смирягина Техред И, Ковач Корректор Л. Анджиевская Заказ 431/11 Тираж 629 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 цей 4000 об/мин, прп температуре ОоС, )Плазму отбрасывают и консервированные красные клетки (ККК) промывают 3 порциями 0,9%-ного физиологического раствора. ККК подвергают лизису путем пятиминутной обработки ультразвуком при комнатной температуре.После этого проводят диализ, помещая по другую сторону мембраны сначала дистил- лированную воду, а затем - 0,005 М фосфатный буферный раствор с рН 6,0 в течеоние 24 час при температуре 4 С (четыре замены второй жидкости, объем каждой порции 4 л); увеличение объема соответствует 1 10%.5Подвергшийся диализу экстракт вносят в колонку (2,5 х 30 см) ДЭАЭ-целлюлозы, приведенной в состояние равновесия с О, 005 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Колонку промывают при скорости течения 240 мл/час при помощи 0,005 М фосфатного буферного раствора. Большая часть гемоглобина появляется при истечении объема элюента, соответствующего объему колонки, а остальную часть удаляют при введении дополнительных 250 мл элюента (обШий объем 450 мл).Элюирование орготеина осуществляют при помощи 4 литров того же буферного растора с повышающейся концентрацией .хлорисого натрия в пределах от 0 до 0,08 М,Измерение содержания меди и цинка иоптической плотности элюата А и Апроизводят такжекак в примере 1.Диализ отобранной фракции, содержащей ффорготеин, проводят, помещая по другую сторону мембраны депонизированную воду, доустановления проводимости, равной, примерно, 03-0,45 мком (обратные микроомы),фильтруют через фильтр с порами в 0,45 мки лиофилизируют,При этом получают примерно 52 мг ор-готеина, выход которого составляет 0,013%из расчета на консервированные красныеклетки; активность, из расчета на содазу,составляет 2500 единиц/мг, что соответствует 75% обшей активности орготеина,как перекисной дисмутазы, первоначальноприсутствующей в продукте лизиса,Колонку регенирируют для повторногоприменения путем промывания ее буфернымраствором, ионная сила которого составляет, по меньшей мере, 0,1 М и доходит до2 М с. последующим ополаскиванием депонизировояной водой.При применении способа, описанного впримере 2, чистый орготеин выделяют изкрасных кровяных клеток человека, кроли-ков, крыс и цыплят.При применении способа, описанного впримере 2, сходные результаты полученыпри использовании ТЭАЭ-целлюлозы и имеющей поперечные связи декстрановой смолы,содержащей дизтиламинозтильные группы,Способ выделения орготеина путем хроматографического фракционированпя на ионообменных смолах орготеинсодержашего мате. риала, о т л и ч а ю ш и й с я тем что, с целью повышения выхода целевого продукта, адсорбцию орготеинсодержашего материала осуществляют на дизтиламинозтил- и триэтиламиноэтил-целлюлозе при рН 6,0, элюируют буферным раствором с ионной силой не более 0,02 Мс последующей десорбцией целевого продукта градиентным. буферным раствором с ионной силой 0,02-0,03 М с отделением фракций элюата с оптической плотностью А или А 8 , содержащих двухвалентные йоны медй й/или цинка.