Способ получения глюконовой кислоты

-щ 4709 И О П И С А НИЕ-. ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Соцйвлиетических Республик(61) Зависимый от патента2) Приоритет 24,03.72 (33) ФРГ 14442.9 осударственнык комитет овета Министров СССР ано 15.05.75. Бюллете ликования описания 2 Мо 18 547.455,623,0(53) Опублик Дата оп по делам изобретении крытни(ФРГ) Ханс Уль Иност Берингер1) Заявител 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОНОВОИ КИСЛОТЫ Изобретение относисобу получения глюккозы,Известен способкислоты окислениемводном растворе привии энзима глюкозоопроцесс не пригоденменения, так как прдезактивируется в тежутка времени и, кр спо тся к улучшенному оновой кислоты из ой глюконислородоеском днако данленногокозоокситкого прчень до получения глюкозы к каталитич сидазы. Од ля промыш этом глю чение коро оме того, оист ный даза омерога. Цель изобретения - упрощения процесса.Предлагается способ получения глюконовой кислоты окислением глюкозы кислоро дом, согласно которому глюкозосодержащий водный раствор пропускают через катализатор - смесь глюкозооксидазы и каталазы, находящихся в непосредственной близости одна от другой в связанном состоянии на но сителе, Предполагается, что при этом в молекулярной сфере происходит реакция циркулирующего типа, при которой образующаяся под действием глюкозооксидазы перекись водорода снова разлагается под действием 25 каталазы, находящейся в непосредственной близости, прежде чем перекись водорода сможет воздействовать на другую молекулу глюкозооксидазы, Дополнительное количество кислорода необходимо лишь при повышенной 30 концентрации глюкозы, поскольку имеющийся кислород постоянно регенерируется.Однако добавлением кислорода к раствору можно значительно ускорить взаимодействие.Предлагаемый способ можно осуществлять без дополнительного введения кислорода, если скорость превращения находится в соответствии с содержанием кислорода, Это может быть достигнуто, когда контакт с энзимом, связанным с носителем, происходит по типу хроматографии в колонке с небольшой скоростью течения или когда, например, содержащий клюкозу раствор повторно циклически пропускают через катализатор.Для насыщения глюкозосодержащего раствора используют чистый кислород или средства, содержащие кислород, например воздух, Предпочтительно добавлять кислород, не содержащий больших примесей посторонних газов.Предлагаемый способ необходимо осуществлять при значениях рН, при которых ферменты - глюкозооксидаза и каталаза - проявляют свою активность. Во время превращения наиболее предпочтительно поддерживать значения рН в интервале между 3, 5 и 8, хотя активность ферментов еще сохраняется и при значениях рН, лежащих выше и ниже указанной области. Особенно хорошие результаты получены при поддержании значений рН в ин60 65 тервале мекду 4,5 и 7, Во многих опьпах максимальная активность была обнаружена призначениях рН от 5 до 5,5. Значения рН, соответствующие максимальной активности, также зависят от природы фермента, например,от того, используют ли каталазу, полученнуюиз плесневых грибков (предпочтительн а),или используют каталазу, полученную из печени млекопитающих животных.Значение рН поддерживают в желаемой области с помощью обычных химических методов регулирования, не оказывающих отрицательного влияния на активность ферментов.Хорошие результаты получены при добавлении щелочей, соединений щелочных металлов,например гидроокиси натрия, углекислогонатрия, гидроокиси калия, пригодны такжеорганические основания.Особенно целесообразно поддерживать значение рН внутри благоприятной области напостоянном уровне, что можно осуществить,например, с помощью автоматического титрования с применением стеклянного электродаи рН-стата. В соответствии с измереннымизначениями рН-электрода рН-стат открываетклапан, который контролирует подачу щелочи, например раствора гидроокиси натрия, вреакционный сосуд,Способ осуществляют при температурах,при которых активность ферментов имееттехнически приемлемую величину. Наиболеепредпочтительно осуществлять способ притемпературах 10 - 60 С, При более высокихтемпературах происходит заметное денатурирование ферментов, а при пониженных - замедление скорости превращения, Особенноблагоприятна температура 25 - 50 С.. Согласно изобретению способ можно осуществлять периодически или непрерывно.Периодический процесс особенно простоосуществлять следующим образом: в реакционный сосуд, в котором находится глюкозосодержащий водный раствор, вводят катализатор и оставляют его в растворе до тех пор,пока не произойдет превращение. При этомцелесообразно, перемешивать раствор, лучшевсего продувать кислородом. После завершения реакции катализатор удаляют, напримерцейтрифугированием, декантацией. Впоследствии,катализатор без дополнительной обработки снова можно использовать, а обработанный раствор также самостоятельно можноприменять.Осуществление способа по циркуляционному принципу дает возможность особенно просто управлять процессом. Кроме того, приэтом варианте можно отделять образующуюся.глюконовую кислоту и, следовательно, удалять ее из равновесной реакционной смеси,благодаря чему превращение протекает особенно быстро и количественно. Глюконовуюкислоту можно отделять обычными методами, например связыванием с помощью анионообменников, переведением в трудно растворимую соль или прочие производные. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Соответствующий нзобретешпо когализатор можно получить фиксированием на подходящем носителе глюкозооксидазы и каталазы, при обработке этого носителя водным раствором, содержащим смесь глюкозооксидазы и каталазы, При этом тип применяемого носителя не имеет особого значения, но важно, чтобы находящиеся в связанном состоянии с носителем глюкозооксидаза и каталаза, сообща находились в непосредственной близости,Наиболее предпочтительно, когда соотношение активностей глюкозооксидазы и ката- лазы 1: 10 илп более. Очень хорошие результаты получены при соотношении активностей до 1:200. Однако и при значительно более высоких соотношениях активностей были получены отличные результаты, Особое преимущество высоких соотношений активностей, т. е. высокая активность связанной каталазы в отношении к активности глюкозооксидазы, заключается в том, что значительно снижается расход кислорода. Это снижение расхода кислорода объясняется немедленным образованием кислорода из перекиси водорода.Получение катализатора А50 г обычного продажного препарата глюкозооксидазы (ГОД) со специфической активностью 220 13/мг растворяли в 1 мл 0,5 и. буферного раствора с рН 8,0 (триэтаноламин - НС 1); затем в токе азота при температуре 30 С полученный раствор смешивали с 0,25 мл 2,3-эпоксипропилового эфира акриловой кислоты и смесь перемешивали в течение 30 мин при указанной температуре. Непосредственно после этого смесь охлаждали до 10 С. Затем в 18 мл дистиллированной воды последовательно друг за другом растворяли 3,0 г акриламида, 0,1 г Х,И-метиленбисакриламида и 300 мг ферментативного препарата с активностью глюкозооксидазы 20 3/мг и активностью каталазы 260 1.1/мг и полученный раствор вводили в реакционный сосуд. После этого, добавляя 50 мг перекиси бензоила и 0,5 мг 5%-ного раствора М,Х-диметиламинопропионитрила, инициировали реакцию полимеризации. После завершения реакции полимеризации (примерно 1 ч) смесь выдерживали примерно в течение 12 - 18 ч при 4 С, Затем полученный полимерный материал продавливали через сито с величиной отверстий 4 мм, промывали и высушивали. Специфическая активность связанного с носителем фермента составляла: глюкозооксидаза 281 1.)/мг, каталаза 185 Б/мг.Полученный препарат впоследствии обозначен как ГОД-каталаза А. Получение катализатора В1,5 г ферментативного препарата с ГОД-активностью 20 11/мг и активностью каталазы 260 11/мг, а также 50 мг каталазы со специфической активностью 39000 11/мг растворяли в 15 мл дистиллированной воды и 7,5 мл 1 М буферного раствора с рН 8,0 (триэтанол 47095145 50 55 60 65 амин - НС 1), Затем г, атмосфере азота при 30 С к приготовленному раствору прибавляли 1,25 мл 2,3-эпоксипропилового эфира акриловой кислоты, После этого реакционную массу слегка перемешивали в течение 30 мин при указанной температуре, охлаждали до 10 С и смешивали с 15 г акриламида и 0,75 мл Х,1 Ч-метиленбисакриламида в 78 мл дистиллированной воды. Добавляя 3 мл 5%-ного раствора аммонийпероксидисульфата и 3 мл 5/о-ного раствора диметиламинопропианитри ла, инициировали реакцию полимеризации. Последующую обработку производили аналогично описанному для катализатора А.Специфическая активность полученной ГОД-каталазы составляла: ГОД 95 У/г, каталаза 4200 11/г.Полученный ГОД-каталаза-препарат впоследствии обозначен как ГОД-каталаза В.П р и м е р 1. Периодическое осуществление способа.20 г (0,11 моль) фруктозы и 1,1 г (0,0055 моль) гидрата глюкозь растворяли в 200 мл воды, Приготовленный раствор помещали в термостатируемый реакционный сосуд, температуру в,котором поддерживали равной 35 С, В реакционном сосуде находился рН-электрод, который через рН-стат аыл связан с бюреткой, наполненной 0,2 и. раствором гидроокиси натрия, Значение рН поддерживалось постоянным и равным 5,5 благодаря тому, что при понижении значения рН в результате образующейся в процессе реакции глюконовой кислоты в реакционный сосуд автоматически подавалось соответствующее количество раствора гидроокиси натрия. Кроме того, в реакционном сосуде имелась трубка для ввода кислорода с фриттой, с помощью которой подавался 1 л кислорода в 1 ч. К раствору фруктозы и глюкозы прибавляли затем 250 мг связанной с носителем глюкозооксидазы са специфической активностью 300 1.1/г. Через 50 мин определяли содержание глюкозы в растворе, Спустя 100 мин 20 ооо введенной глюкозы превращалось в глюконовую кислоту.Описанный выше способ повторяли с тем отличием, что дополнительно примешивали к раствору 2 мг каталазы со специфической активностью 40000 1 Ямг. Через 100 мин степень превращения глюкозы составляла 30/о, спустя 200 мин - 40 о/о. При еще более продолжительном времени реакции глюкозооксидаза инактивировалась,Описанный способ повторяли, однако вместо связанной с носителем глюкозооксидазы и растворимой каталазы к раствору примешивали описанный выше ГОД-каталаза-препарат А в количестве 250 мг. Через 100 мин степень превращения составляла 50%, спустя 200 мин - 70 о/, от взятого количества гл юкозы. Инактивирования фермента не происходило, и при более продолжительном време 5 10 20 25 30 35 40 ни взаимодействия пракгически всО глоказ можно превратить в глюконовую кислоту,Описанный способ повторяли еще раз, используя указанный ГОД-каталаза-препарат В. Через 100 мин степень превращения составляла примерно 40%, спустя 200 мин 94/о глюкозы превращалось в глюконавую кислоту. Через 220 мпн превращалась более 99% глюкозы,Описанные опыгы показывают, что при осуществлении изобретения, несмотря на значительно более низкую ферментативную активность, достигаются более высокие степени превращения. Кроме того, не происходит заметного инактивирования катализатора, в то время как в опытах для сравнения, проведенных без каталазы и с растворимой каталазой, несмотря на более высокую ферментативную активность, происходит быстрое необратимое ипактивирование ферментов.П р и м е р 2, Превращение по непрерывному принципу.1 г связанного с носителем ГОД-каталазапрепарата В суспендировали в дистиллированной воде и препарату давали возможность набухать. Непосредственно после этого препаратом заполняли колонку с внутренним диаметром 20 мм и длиной 5 см. Через эту колонку со скоростью 1,2 л/ч пропускали раствор 50 г фруктозы и 2,75 г гидрата глюкозы в 500 мл воды, которая при температуре 25 С была освобождена от присутствия воздуха. После прохождения реакционного раствора значение рН снова доводили до 6,5, прибавляя 0,2 н, раствор гидраокиси натрия, пропускали кислород и затем раствор снова пропускали по циркулирующему принципу через колонку, За каждый проход 100 - 120 мг глюкозы превращалось в глюконовую кислоту. Через 23 прохода превращалось более 99% глюкозы. П р и м ер 3. Повторяли способ, описанный в примере 2, однако ферментативную колонку последовательно подключали к анионообменной колонке (загрукена ацетатом 1 МАС А 27), а значение рН регулировали, добавляя раствор гидроокиси натрия. Выходящий из анионообменной колонки раствор содержал лишь 0,086 о/, глюконовой кислоты в расчете на содержание фруктозы. П р и и е р 4. Описываемый опыт показывает, что скорость превращения глюкозы зависит от соотношения глюкозы и ГОД-ката- лаза-катализатора в растворе.Способ осуществляли аналогично периодическому способу, описанному в примере 1, причем раствор 20 г фруктозы и 1,1 г глюкозы смешивали при температуре 40 С, при рН 5,5 и при пропускании воздуха с применяемым в соответствии с изобретением катализатором А. Результаты, полученные через 100 мин с различными количествами катализатора при. ведены ниже.Степень превращения глюкозы через 100 мин, , 100 250 500 24 б 9 97 Предмет изобретения Составитель А, Кост Редактор Е, Хорина Корректор Е. Рогайлина Техред Г. Дворина Заказ 1970/17 Изд. Мо 1434 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 1. Способ получения глюконовой кислоты посредством окисления кислородом глюкозы в водном растворе при каталитическом действии энзимы глюкозооксидазы с последующим выделением целевого продукта известными приемами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве катализатора применяют смесь глюкозооксидазы н каталазы, находящихся в непосредственной близости одна от другой в связанном с под ходящим носителем состоянии.2. Способ по 1, отличающийся тем,что в раствор, содержащий глюкозу, дополнительно подают кислород.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся 10 тем, что рН реакционной смеси поддерживают в интервале от 3,5 до 8, преимущественно между 4,5 и 7, добавлением щелочи или удалением образующейся глюконовой кислоты.4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся 15 тем, что процесс ведут при 10 - 60 С, преимущественно 25 - 50 С.