Способ культивирования штамма bacillus аuтrасis

.т:.Дф СВИДЕТЕЛ ЬСТ РСК К тельскии ии и микЮ,В.Чис, В.В,СеШТАМГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) Авторское свидетельство ССС(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИМА ВАСШ 35 АЙТНВАСЯ Изобретение относится к микробиологии, в частности к биотехнологии вакцин ных препаратов, и может быть использовано при изготовлении вакцин,В настоящее время в СССР применяют две живые споровые вакцины против сибирской язвы: вакцину из штамма 55-ВНИИВВиМ и вакцину иэ штамма СТИ,Известен способ культивирования возбудителя сибирской язвы в жидкой среде с питательной основной из дрожжевого экстракта, Он позволяет за 1,5-2 су 1 ок получйть в реакторе споровый материал для изготовления вакцины из штамма СТИ, Однако его невозможно применить при производстве биопрепарата из штамма 55- ВНИИВВиМ, т.к. указанный штамм обладает биологическими особенностями и не образует споры в жидкой дрожжевой среде, Это является одной из основных характеристик невозможности получения 1791449 А 1 й 3/00, А 61 К 39/10(57) Использование: микробиологическая промышленность, производство вакцин. Сущность изобретения: штамм бактерий Вас,аптгас з 55-ВНИИВВИМ выращивают на водной питательной среде, содержащей (на 1 л): кислотный гидролизат говяжьего мяса 60 - 80 мл; аммоний сернокислый 1,5 - 2,5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный 3,0 - 12,0 г; натрий лимоннокислый 0,8-1,2 г; магний сернокислый 0,15 - 0,25 г; полипропиленгликоль 0,08-0,12 мл, в течение 46-50 ч при аэрации, при этом первые 27-29 ч скорость растворения кислорода в среде поддерживают 3,5 +0,2 ммоль на 1 л среды в 1 ч. вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ в реакторе по указанному способу,Вакцину из штамма 55-ВНИИВВиМ изготавливают в 3-литровых бутылях на картофельно-пептонном агаре. Для получения спорового материала на одну серию вакцины необходимо проделать следующие операции: подготовить 200-400 штук 3-литровых бутылей (вымыть их, залить расплавленным агаром, простерилиэовать, обкатать, выдержать на стерильность), засеять эти бутыли матричной расплодкой вакцин- ного штамма, поставить на инкубирование, иэ 10-20 бутылей приготовить мазки для контроля спорообразования, смыть с партии из 200 - 400 бутылей споровой материал и профильтровать его. На получение спорового материала необходимо 6-7 суток, не считая времени на подготовку посуды и питательных сред. Все вышеуказанные операции выполняются вручную. Кроме того. в20 процессе работы часть стеклопосуды бьется, а биопредприятия испытывают трудности в обеспечении специальной стекл опосудой,Целью изобретения является сокраще ние времени на получение спорового материала.Зто достигается тем, что в известном способе изготовления вакцины против сибирской язвы, включающем выращивание 10 микроорганизмов при температуре 36- 37 на питательной среде, культивирование осуществляют в реакторе с использованием разработанной нами и апробированной жидкости споруляционно ростовой среды следующего состава:кислотный гидролизатговяжьего мяса 60 - 80 мл аммоний сернокислый(ТУ 6-09-10-1244-77) 0,08 - 0,12 мл дистиллированная вода 30 (ГОСТ 6709-72) до 1000 мл рН 7,2 + 0,2.Другое отличие заключается в иных условиях культивирования; выращивание проводят в течение 46-50 часов. В первые 35 27-29 часов культуру штамма аэрируют воздухом путем барботирования без перемешивания мешалкой, уровень аэрации составляет 3,5 0,2 ммоль растворенного кислорода на 1 л среды в 1 час, затем аэри рование прекращают и культуру выдерживают 19-21 час до завершения спорообразования.Накопление биомассы завершается через 12 часов после посева. Спустя 27-29 45 часов 95-100,4 выросших клеток образуют споры, которые находятся на разных стадиях созревания. В последующие 19-21 час инкубирования происходят созревание спор и полный лизис вегетативного матери ала. На завершающем этапе выращивания культура состоит из зрелых светопреломляющих спор, количество которых в 1 мл составляет 100-300 млн.Способ получения спор разработан на 55 5-литровом ферментере "Бромма" (фирма ЛКБ, Швеция) и воспроизведен в 63-литровом реакторе. Уазанный способ может быть осуществлен в сосудах для культивирования различного обьема, но для этого необходимо знать массообменные по кислороду характеристики используемых сосудов. Массообмен по кислороду можно определить по сульфитному методу, разработанному Купером и усовершенствованному во ВНИИВВиМ Бакуловым И.А, с соавторами (Тез.докл,научн.-теоретич.конф. ВНИИВВиМ 14 - 16 ноября 1983 г с,178 - 180, г,Покров),П р и м е р 1. Определение массообмена по кислороду в 63-литровом реакторе, выращивание культуры штамма 55-ВНИИВВиМ и получение спор.Определение массообменна,В реактор заливают 39 литров дистиллированной воды, в ней растворяют порошок сульфита натрия в количестве 240,0 г. Отдельно в 1 литре дистиллированной воды растворяют кристаллы сернокислой меди в количестве 10,0 г. Раствор сернокислой меди заливают в реактор и получают 40 литров смеси растворов с содержанием сульфита натрия 6,0 г/л и сернокислой меди 0,25 г/л,Из реактора с помощью шприца объемом 5 мл и присоединенных к нему 2 пипеток с узким канальцем набирают 5 мл раствора (1-я проба до аэрации), которые переносят в колбу с 70 мл свежеприготовленного 0,01 Н раствора йода, В шприце с пробой не должно быть пузырьков воздуха.зПодают сжатый воздух в количестве 0,5 дм /л воды/мин или 20 дм /40 л воды/мин,3Фиксируют время аэрации,Оттитровыввают 1-ю пробу (до аэрации) в растворе йода добавлением 0,01 М раствора гипосульфита натрия до перехода жидкости из коричневого в желтый цвет, Затем добавляют 3 - 4 капли 0,50,-ного раствора крахмала, Цвет жидкости становится темно- синим. Продолжают добавлять раствор гипосульфита натрия до полного обесцвечивания жидкости,Например, на титрование пробы потребовалось 6,2 мл раствора гипосульфита натрия,Шприц с пипетками и колбу для титрования промываютдистиллированной водой,По истечении времени аэрации (30 минут) воздух отключают, отбирают 2-ю пробу (аэрация 0,5 дм /д/мин) и оттитровывают ее3так же, как и 1-ю пробу,Например, на титрование пробы потребовалось 8,6 мл раствора гипосульфита натрия.По формуле определяют уровень аэрации Т 1 - То х 2,5 ммольВ 5рх млх 1 час, где.= 6,6 ммо 02/л/час П ее титрощательноой.овые зна- пользуют вания ш промываТаки чения 3- для постПолу лить ско в опредеда (урогде То - количество гипосульфита натрия,израсходованного на титрование пробы доаэрации;Т 1 - - - - - после аэрации;Вр - время аэрации (час);5 мл - объем пробы;2,5 ммоль - один литр 0,01 М растворагипосульфита связывает 2,5 ммоль 02.Например т,е. при подаче 0,5 дм воздуха/л/мин в реакторе создается уровень аэрации, равный 2,4 ммоль 02/л/час.Сразу после отбора 2-й пробы вновь подают сжатый возух для барботирования в количестве 1 дм /л/мин. По истечении 30-минутного аэрирования воздух отключают отбирают 3-ю пробу (аэрирование 1 дм /л/мин), оттитровывают ее, определяют уровень аэрации по формуле, причем в этот же раз То будет служить Т 1 из предыдущего расчета,Например, на титрование 3-й пробы было израсходовано 13 мл раствора гипосульфита натрия. Определяют уровень аэрации: Сразу после отбора 3-й пробы вновь подают сжатый воздух для барботирования в количестве 1,5 дм /л/минПосле 30-минутного аэрирования воздух отключают, отбирают 4-ю пробу (аэрация 1,5 дм /л/мин), оттитровывают ее, определяют по формуле уровень аэрации, причем То будет Т из предыдущего расчета.Например, на титрование 4-й пробы было израсходовано 19,6 мл раствора гипосульфита натрия. Определяют уровень аэрации: е каждого отбора пробы иприц, пипетки и колбу тют дистиллированной водм образом, получают числх измерений, которые исроения графика.ченный график позволяерость растворения кислор 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 вень аэрации) при подаче известного количества воздуха для барботирования средыи, наоборот, количество воздуха, котороепотребуется для создания необходимогоуровня аэрации,Выращивание культуры штамма 55 ВНИИВВиМ и получение спор.В реакторе объемом 63 литра приготавливают 40 литров споруляционно-ростовойсреды по прописи (см.выше). Реактивы растворяют в той же последовательности, в которой они написаны, Устанавливают рНсреды 7,2+6,2 добавлением 20;-ного раствора гидроокиси калия, Среду стерилизуютпри 121 С в течение 45 минут и охлаждаютдо 30 - 35 С,В реактор с питательной средой заливают через пробоотборник посевной материал - споровую суспензию штамма55-ВНИИВВиМ в количестве 2 - 10 х 10 жизнеспособных спор, что составляет 0,52,5 х 10 спор на 1 мл среды. Весь посевной6материал должен содержаться в объеме0,5 - 2,0 л.Устанавливают температуру инкубирования 37 С, в питательную. среду подаютсжатый воздух через барботер в объеме 0,8дм /л/ среды, что по графику массообменазсоответствует уровню аэрации 3,5ммоль Огл/час, Культивируют 27 часов,Следующие 21 час культуру инкубируютпри той же температуре, но без аэрирования.Через 27 и 48 часов культивирования иэреактора отбирают пробы культуры, исследуют их на чистоту роста и спорообразование.Культура вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, выращенная в этих условиях, состоит из зрелых жизнеспособных спор,количество которых в 1 мл составляет 100300 млн.Использование предлагаемого способаполучения споровой формы вакцинногоштамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы обеспечивает следующие преимущества:позволяет получать в реакторах большие объемы спорового материала для изготовления вакцины против сибирской язвы:значительно снижает затраты труда наизготовление вакцины против сибирскойязвы, ликвидирует тяжелый ручной труд, позволяет механизировать производственныйпроцесс;сокращает время на получение спороого материала в 3-4 раза.Формула изобретенияСпособ культивирования штаммаВасИЬэ апйгасэ 55-ВНИИВВиМ на пита1791449 Составитель И. ВишняковТехред М,Моргентал Корректор С.Патрушева Редактор С, Кулакова Заказ 134 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 тельной среде, содержащей органический источник азота до максимального образования спор, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени на получении спорового материала, в среду 5 дополнительно вводят калий фосфорно- кислый двузамещенный, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, полипропиленгликоль и воду, а в качестве источника азота используют кислот ный гидролизат говяжьего мяса и аммоний сернокислый, при этом указанные компоненты вводят в следующем соотношении: кислотный гидролизатговяжьего мяса -60-80 мл; аммоний сернокислый - 1,5-2,5 г; калий фосфорнокислыйдвузамещенный - 3,0-12,0 г; натрий лимоннокислый - 0,8-1,2 г; магний сернокислый - 0,15-0,25 г; полипропиленгликоль - 0.08-0,12 мл; вода - до 1000 мл, . при этом культивирование осуществляют в течение 46 - 50 ч, из них первые 27-29 ч при аэрации, поддерживая скорость растворения кислорода в среде 3,5 Ф 0,2 ммоль на 1 л сРеды в 1 ч.