Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений

(71) Отдел биохимии и циского научного центра Уния АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТИММОБИЛИЗАЦИИ АМИНОСОЩИХ СОЕДИНЕНИЙ(57) Использование: получение высого носителя для иммобилизации а тохимии Башкирральского отделеркеочещептгу, 1970,ЕЛЯ ДЛЯ ДЕ РЖАкоем ко миносо осится к области быть использован ких сорбентов, об механической пр стью к химиче Изобретение отнтехнологии и можетполучения высокоемющих значительнойстью и устойчивовоздействиям.Наиболее часто применяемлями для иммобилизации биолтивных соединений до настоящявляются полисахаридные мэтриз методов, позволяющих получс высокой специфической емкосся метод, включающий в себя сдегидкрахмала-продукта пеокисления крахмала, метиленвосстановление образовавшиний Шиффа боргидридом натррование остаточных аминоарилпоследующее связывание белкпо связыванию для этого носитеет 80 - 100 мг/г, специфическу биодля ада- чно- ким ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) ыми носитеогически акего времениицы, Одним ить сорбент тью,являетшивку диальриодатного дианилином, хся основдия, дидзотиьных групп и ов. Емкость ля составляю активность держащих соединений, обладающего повышенной эффективностью и работоспособностью. Сущность изобретения, способ осуществляется окислением раствора поливинилового спирта перйодатом натрия из расчета 5 - 7 мг перйодата на 1 мл 10%-ного водного раствора поливинилового спирта. Гель формируют путем выдержки окисленного продукта при рН 1, температуре 37 С, в течение 48 ч с последующим измельчением и дополнительной обработкой при аналогичныхусловиях(рН 1,Т=37 С,48 ч)5-ным раствором глутарового альдегида. При этом соотношение между гомогенизированным гелем и раствором глутарового альдегида составляет 1:1 по объему. сохраняет 25 - 55 связанного белка. Обычно носитель диальдегидкрахмал-метилендианилин используется для получения иммобилизованных ферментов,Недостатками указанного способа иммобилизации являются: многостадийность и использование высокотоксических веществ; плохие колоночные свойства носителя, препятствующие широкому распространению этого метода иммобилизации лигандов; нестабильность носителя при крайних значениях рН и неустойчивость к действию ферментов микроорганизмов,Цель изобретения - увеличение работообности и повышение эффективности.Предлагаемый способ заключается в получении альдегида поливинилового спирта /ПВС-полиальдегида/ путем окисления 10% раствора поливинилового спирта /ПВС/ с молекулярным весом 30 тыс, Д периодатом натрия из расчет 5-7 мг периодатана 1 мл 10 ф -ного раствора ПВС в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей сшивкой полученного продукта за счет протекания реакции ацетилирования остаточных гидроксильных групп ПВС, составляющих около 95от их исходного количества, образовавшимися альдегидными группами при рН 1, 37 С в течение 48 ч, в течение которых формируется гель необходимой пористости. Полученный блок затем размельчается и подвергается дополнительному упрочнению и активации. Зто достигается обработкой гомогенизированного измельченного геля 54-м раствором глутарового альдегида при рН 1, 37 С, при объемном соотношении гомогенизированного геля и 5-ного раствора альдегида 1;1, При этом глутаровый альдегид ацетилирует оставшиеся гидроксильные группы, Для иммобилизации же аминосодержащих соединений используются как альдегидные группы ПВС-альдегида, не вступившие в реакцию при формировании геля, так и альдегидные группы, введенные за счет ацетилирования носителя глутаровым альдегидом,Полученный этим способом носитель обладает хорошими колоночными свойствами, не разрушается при действии крайних значений рН, органических растворителей, детергентов, ферментов микроорганизмов, выдерживает кипение. В ходе изготовления носителя происходит его стерилизация. Высокая плотность альдегидных групп /80 мкмоль/мл/, наряду с развитой поверхностью, обеспечивает возможность изготовления на основе предлагаемого носителя сорбентов с высокой емкостью,П р и м е р (прототип), К 200 мл 5-ного крахмала, окисленного периодатом натрия из расчета 7 мг периодата на 1 мл раствора при комнатной температуре в течение 30 мин, добавляют 40 мл карбонатного буфера рН 10,5, 2 М. Полученный раствор медленно вливают в энергично размешиваемый 104 раствор метилендианилина в метаноле /400 мл/. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 3 дня. Нерастворимые частицы сшитого полимера промывают на воронке Бюхнера метанолом, суспендируют в воде и восстанавливают боргидридом натрия из расчета 40 г на полученное количество носителя в течение 18 часов при комнатной температуре, Реакционную смесь нейтрализуют уксусной кислотой, гель промывают водой и метанолом /по 300 мл/ и высушивают на воздухе.100 мг высушенного носителя суспендируют в 8 мл 50-ной уксусной кислоты и перемешивают 1 ч, Водный раствор нитрита натрия /20 мг/мл/ добавляют по каплям к 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 полученной суспензии при охлаждении, смесьперемешивают 1 часпри 0 Си затем доводят рН до 8,5 5 Н едким натром, Нерастворимый полимер промывают 0,2 М фосфатным буфером рН 7,8 на воронке Бюхнера и суспендируют в 6 мл того же буфера, затем постепенно добавляют 10 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, Смесь перемешивают в течение ночи при 4 С и промывают на воронке Бюхнера 200 мл 1 М хлорида калия, 100 мл дистиллированной воды и суспендируют в забуференном 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2 физиологическом растворе (ЗФР). Затем проводят аффинное выделение человеческого иммуноглобулина из сыворотки в колонке. С 1 мл носителя элюировано в среднем 8,5 мг иммуноглобулинов. Максимальная скорость тока колонки падает в 2 раза в течение часа,П р и м е р 2, 100 мл 10-ного раствора ПВС окисляют периодатом натрия, добавляя при постоянном помешивании 700 мг периодата натрия и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Окисление проходит в течение первых минут процесса, при этом вязкость достигается 4,41 - 4,28 м /с и2 в дальнейшем с увеличением времени окисления практически не меняется. Затем рН доводят соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37 С. Полученный блок разбивают при помощи ножевого гомогенизатора, промывают на воронке Бюхнера 400 мл дистиллированной воды и суспендируют 200 мл 5 глутарового альдегида, доводят рН концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37 С, При этом объемное соотношение гомогенизированного геля и 5 -ного раствора глутарового альдегида составляет 1:1, Если расчитывать это объемное соотношение на гель в форме блока, то оно равно 1:2, При гомогенизации объем геля увеличивается в 2 раза и это приводит к изменению соотношения, причем объем гомогенизированного геля может незначительно варьироваться. 3 мл полученного носителя отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды по Шиффу, а затем карбонатным буфером рН 8,5 0,1 М, К 3 мл отмытого носителя добавляют 3 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, выдерживают в течение ночи при 4 С, закрывают непрореагировавшие альдегидные группы 0,1 М моноэтаноламином при рН 8,0 в течение 4 ч при 22С, восстанавливают основания Шиффа боргидридом натрия /1 мг/мл/ в течение 4 ч при комнатной температуре,отмывают ЗФР и загружают в колонку для1789532 10 15 20 25 30 35 40 45 проведения аффинного выделения иммуноглобулинов человека, С 1 мл носителя элюировано в среднем 9 мг иммуноглобулинов, Максимальная скорость тока колонки с диаметром 20 мм и объемом носителя 3 мл оставалась неизменной в течение 5 циклов аффинного выделения /10 ч/.П р и м е р 3. 100 мл 10-ного раствора ПВС окисляют периодатом натрия, добавляя при постоянном перемешивании 500 мг периодата, выдерживают при комнатной температуре 30 мин. При этом достигается вязкость 5,25-5,18 м /с, после чего доводят2рН концентрированной соляной кислотой до рН 1 и выдерживают при 37 С 48 ч. Полученный блок разбавляют ножевым гомогенизатором, промывают на воронке Бюхнера 400 мл дистиллированной воды и суспендируют в 200 мл 5% глутарового альдегида, доводят рН концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37 С. Полученный носитель отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды по Шиффу, карбонатным буфером рН 8,5, 0,1 М, К 3 мл отмытого носителя добавляют 3 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, выдерживают в течение ночи при 4 С, закрывают непрореагировавшие альдегидные группы 0,1 М моноэтаноламином при рН 8,0 в течение 4 ч при комнатной температуре, восстанавливают основания Шиффа боргидридом натрия в концентрации 1 мг на миллилитр при комнатной температуре втечение 4 ч, отмывают ЭФР и загружают в колонку для проведения аффинного выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека, С 1 мл носителя элюировано в среднем 8,5 мг иммуноглобулина, что достоверно не отличается от количества иммуноглобулинов, полученного в примере 2, Изменения максимальной скорости тока колонки в течение 5 циклов аффинного выделения (10 ч) не наблюдались.П р и м е р 4 /контрольный/, К 100 мл 10%-ного раствора ПВС добавляют при пеФормула изобретения Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. включающий окисление перйодатом карбоцепного гидроксилсодержащего полимера и формирование геля на основе продукта окисления, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности и увеличения работоспособности носителя, в качеремешивании 700 мг периодата натрия и выдерживают при комнатной температуре 30 минут. Затем рН доводят концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 20 ч при 37 С, Дальнейшие стадии проводят как в примере 2, С 1 мл полученного сорбента элюировано в среднем 1,5 мг иммуноглобулинов. Снижение емкости произошло, очевидно, из-за уменьшения активной поверхности носителя в результате формирования геля с более мелкими порами, Ухудшение колоночных свойств не зафиксировано,П р и м е р 5 (контрольный). Формирование геля проводят по примеру 2. К измельченному и промытому гелю добавляют 200 мл 5/,-ного раствора глутарового альдегида, доводят рН до 1 концентрированной соля ной кислотой и выдерживают 24 ч при 37 С. Последующие операции проводят аналогично тому, как это делалось в примере 2. Среднее значение емкости полученного сорбента составило 5 мг иммуноглобулина с 1 мл сорбента,Таким образом из приведенных примеров следует, что оптимальным условием получения носителя по предлагаемому способу является формирование геля на основе окисленного периодатом натрия 10 о -ного раствора поливинилового спирта путем его выдержки при рН 1, 37 С в течение 48 ч с последующей гомогенизацией геля измельчением и обработкой при аналогичных условиях 5%-ным раствором глутарового альдегида при равном объемном соотношении, В результате такой обработки происходит повышение эффективности (улучшение колоночных свойств) и повышение работоспособности носителя, что, очевидно, обуславливается формированием геля необходимой пористости и емкости для сорбции соответствующих аминосодержащих соединений, а также его упрочнение за счет дополнительной сшивки глутаровым альдегидом. стве гидроксилсодержащего полимера используют 10 о -ный раствор поливинилового спирта, окисление перйодатом натрия производят из расчета 5 - 7 мг перйодата на 1 мл водного раствора поливинилового спирта, последующее формирование геля осуществляют путем выдержки окисленного полимера при рН=1, температуре 37 в течение 48 ч до получения геля в форме блока с последующей гомогенизацией геля измель1789532 10 15 20 25 30 Составитель Г.ОвчинниковаТехред М,Моргентал Корректор Л,Пилипенко Редактор С.Кулакова Заказ 327 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 чением и обработкой при рН=1. температуре 37 С в течение 48 ч 5%-ным раствором глутарового альдегида при объемном соотношении гомогенизированного геля и 5 ф,ного раствора глутарового альдегида, равном 1;1.