Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОБРЕ ОПИ АНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Иркутский государственный медицинский институт и Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии(54) СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗОВ Изобретение относится к медицине, предназначено для серологической диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза) в иммуноферментном анализе.Целью изобретения является упрощение диагностики за счет экспресс-диагностики.Способ осуществляют следующим образом.Для получения протеинового антигена, свободно секретируемого в культуральную среду, используют любую культуру патогенных иерсиний, в частности у,рзеобо 1 цЬегсцогв 01. Вирулентность возбудителя контролируют в тесте аутоагглютинабельности или по плазмидному спектру (наличие Са-зависимой плазмиды вирулентности), Суточную культуру с агара Хоттингера (рН 7,0-7,4) пересевают в бульон Хоттингера в соотношении 1:40, содержащий 20 мМ/л хлорида магния. Для создания оптимальных условий синтеза протеинового антигена, ассоциированного с плазмидой вирулентно.Ы./ , 17674351)5 8 01 й 33/535(57) Изобретение относится к области медицины, предназначено для серологической диагностики иерсиниозов (иерсиниозэ и псевдотуберкулеза) в иммуноферментном анализе. Цель - упрощение способа за счет экспресс-диагностики, В исследуемой сыворотке крови определяют антитела к общему для родэ протеиновому антигену роде Оегзпа и при значении реакции, превышающем средние значения обследования практически здоровых лиц на удвоенное среднее квадратичное отклонение, диагностируют заболевание. За положительные принимают значения реакции в ЕД ИФА более 235,4, 1 табл. сти, предварительно бульон Хоттингера обрабатывают оксалатом натрия (20 мМ/л) с целью удаления ионов Са . Через 12-16 ч бактериэльные клетки удаляют центрифугированием (7000 д, 4 С, 20 мин). Для осаждения продуцируемого в среду протеинового антигена в супернатант добавляют сульфат аммония из расчета 40 гр на 10 мл. Далее, через 8 - 12 ч инкубации при температуре 3 4 С, центрифугированием собирают корич нево-желтый осадок протеинового антиге- (,А) нэ, Полученный антиген диализуют в (Л течение 2 сут против водопроводной воды и сутки против дистиллированной воды.Постановку ИФА осуществляют в стандартном непрямом варианте. Первоначально готовят рабочее разведение протеинового антигена - 12,5-25,0 мкг/мл (по белку) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере (рН 8,0 - 9,0), Сенсибилизацию полистироловых планшет протеиновым антигеном проводят в течение 16 часов при 4 С. После инкубации планшеты тщательно от10 30 40 45 55 мывают от несвязавшегося антигена эабуференным физиологическим раствором (ЗФР с 0,05 ф твином. Затем в парные лунки полистироловых планшет вносят исследуемые образцы сыворотки крови в разведении 1:400 (скрининг-титр) в ЗФР с 0,050 ь твиномпо 100 мкл. Инкубируют при температуре 37 С в течение 1 ч. После отмывки несвязавшихся антител ЗФР-ром с теином в л .ки вносят коньюгат антител к иммуногло улинам человека, меченных пероксидаэой в рабочем разведении и оставляют при 37 С еще на 1 ч,После отмывки планшет в лунки вносят субстратную смесь, состоящую из 10 мг арто-фенилендиамина, 0,35 мл 3 перекиси водорода на 25 мл цитратного буфера (рЬ 5,0). Через 10 минут ферментативную реакцию останавливают добавлением 10 раствора серной кислоты по 50 мкл в лунку, Учет реакции проводят на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм, предварительно выставив бланк на приборе. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА), рассчитываемых по формуле (Бюлл. ВОЗ, 1985):ЕЛ ИФА = "х 100,ОДогде ОДх - средняя оптическая плотность лунок с исследуемыми образцом;ОД 0- средняя оптическая плотность лунок с пулом донорских сывороток.Для учета уровня популяционного иммунитета, при выработке контрольных показателей, предварительно проводят обследование не менее 30 практически здоровых лиц, проживающих на территории, где проводится исследование.При анализе сывороток крови больных за положительные принимаются показатели (в ЕД ИФА), превышающие значения кон,троля на удвоенное среднее квадратическое отклонение (И.В,Поляков и соавт. Практическое пособие по медицинской статистике, Л., 1975).Поскольку протеиновый антиген впервые использовали для определения специфических антител в иммуноферментном анализе, предварительно был проведен ряд модельных опытов по оптимизации условий реакции. Дозу сенсибилизации полистирола подбирали экспериментально в диапазоне концентраций протеинового антигена 100,0-50,0-25,0 - 12,5 - 6,25 - 3,12 мкг (по белку) на 1 мл буфера. В качестве комплексующих буферов испытаны карбонат-бикарбонатный(рН 8,0-9,0 - 10,0) и фосфатный(рН 7,0). Первоначальное разведение протеинового антигена (100 мкг/мл) титровали в 2-х кратном интервале до конечной концентрации 3,12 мкг/мл комплексующего а,фера. Сенсибилизацию полистирола проводили протеиновым антигеном в концентрации от 3,12 до 100,0 мкг/мл в течение 16 часов при 4 С и при значении рН буфера 7,0 - 8,0 -9,0 - 10,0. После инкубации планшеты тщательно отмывали и в каждую лунку вносили по 100 мкл кроличьей антисыворотки к в разведении 1:400 (скрининг-титр). После добавления коньюгата и проявления реакцию учитывали на вертикальном фотометре МР "ОупатесЬ". Результаты выражали в единицах ИФА по отношению оптической плотности лучок с гипериммунной сывороткой к оптической плотности пула 10 кроличьих неиммунных сывороток, Для учета возможных погрешностей измерения для каждой концентрации протеинового антигена и рН буфера проводились исследования по 8 лункам, рассчитывалась средняя арифметическая и ее ошибка.Показано, что увеличение сенсибилизирующей концентрации протеинового анти- гена от 3,12 до 12,5 мкгlмл буфера приводило к повышению чувствительности тест-системы, которая в последующем оставалась примерно на одном уровне независимо от роста концентрации антигена.Изучение зависимости чувствительности тест-системы от рН комплексующего буфера выявило, что наиболее высокие результаты соответствуют рН 8,0-9,0 (808- 898), что достоверно выше, чем при значениях рН 7,0 и 10,0, при одинаковой сенсибилизирующей концентрации антигена.Таким образом, наилучшие условия, обеспечивающие максимальную чувствительность тест-системы на основе протеинового антигена наблюдались при дозе сенсибилизации 12,5 и более мкг/мл карбонат-бикарбонатного буфера рН 8,0-9,0.Все дальнейшие исследования и клинические испытания диагностической системы проводили с учетом выбранных оптимальных условий сенсибилиэации, т.е, концентрации антигена 12,5 мкг/мл на карбонат-бикарбонатном комплексующем буфере, рН 8,0. Специфичность и чувствительность тест-системы в отношении антител к иерсиниям других серотипов, оценивали путем исследования комерческих агглютинирующих сывороток против бруцели, сальмонелл, шигелл, нормальной кроличьей сыворотки, а также кроличьих антисывороток к У.рзецбосоЬегсц 1 ог 3 1, 111, 1 Ч;1 емегосо 1 сса 0,3, 05.27, 09. Антииерсиниоэные сыворотки были получены в лаборато1.6746 15 до 69 лет, из них женщин было 148, мужчин - 108. Диагноз иерсиниоза или псевдотуберкулеза был подтверждену 78 из 256 обследуемых больных на основании клинико-эпидемиологических данных и резуль татов бактериологического исследования, 45 пищевые токсико-инфекции -11, бруцеллез - 5511, острая дизентерия - 10, острые респирарии сапронозоь 1 ЙИИЗ МЗ СССР после трехкратной и.,низации животных культурами иерсиний, инактивированными 50 раствором спирта. Активность полученных сывороток контролировали в реакции иммунодиффузии в геле,За диагностически значимь.е принимали"показатели оптической плотности лунок с антисывороткой, превышающие не менее чем в 2 раза значения оптической плотнослунок с нормальной кроличьей сывороткой в одинаковых разведениях, Из представленных данных видно, что диагностическая система выявляла антитела по всех антисыворотках к иерсиниям, независимо от вида и серотипа иерсиний в титрах,1:6400 - 1:25600, Положительных результатов при испытании антисывороток к другим энтеробактериям в разведении 1;200 (минимальное разведение) и выше обнаружено не было.Таким образом, в предварительных опытах было показано, что при выбранных условиях сенсибилизации антигена на твердой фазе тест-система обладает специфичностью по отношению к антииерсиниозным антителам и достаточно чувствительна (1:6400-1:25600).Клинические испытания предложенного способа проводились на базе серологической лаборатории и диагностического отделения инфекционной больницы М 1 г. Иркутска с сентября 1989 г по май 1990 г. За это время были исследованы сыворотки крови 256 больных, направленных на обследование и лечение в ГИБ М 1 с подозрением на иерсиниоз и псевдотуберкулез, Возраст больных варьировал на иерсиниоз и псевдотуберкулез. Возраст больных варьировал от Причем, псевдотуберкулез, вызванный 1 серотипом возбудителя, выявлен у 49 больных, иерсиниоз, вызванный 03 серотипом -у 5, 05.27 серотипом - у 4 и 09 - у 12 человек У остальных 178 больных (вторая группа) оказались инфекционные заболевания неиерсиниозной этилогии (вирусный гепатит"А" - 54 человека, вирусный гепатит "В" - 24, сальмонеллез - 14, трихинеллез - 12,торно-вирусные инфекции - 10, ангина - 7,клещевой сыпной тиф Северной Азии М 6,брюшной тиф - 6, корь - 4, клещевой энце-, фалит - 4, хронический гепатит - 3, серо 5 10 15 20 25 30 зный менингит - 1, лекарственная болезнь - 1). Исследования сывороток на антитела к иерсиниям проводились в обеих группах на 2 - 4 неделе заболевания как с использованием прототипа, так и предлагаемого способа (табл, 1).Сравнительная оценка эффективности прототипа и оазработанного способа диагностики иерсиниозов показаны в таблице.Как видно из приведенных дайных, путем известного способа диагностики (прототип специфические антитела были обнаружены в диагностическом уровне у 62 из 78 больных иерсиниозами (79,5 й 4,6) и у 18 больных с другими заболеваниями (1 0,1,2 ) в том числе у 5 больных бруцеллезом, Положительные результаты реакции с сывороткой крови больных бруцеллезом служат подтверждением известного факта существования в высокой степенитожде- ственных детерминант" полиполисахаридов иерсиний серотипа 09 и различных видов бруцелл, что определяет ложноположительные реакции;При использовании разработанного способа эффективность диагностики, т,е, процент подтверждения диагноза в группе больных иерсиниозами былнесколько выше (84,6+4,2), хотя статистически разли- чия недостоверны, р0,1, Положительные реакции в группе больных с другими инфек- ционными заболеваниями составили 7,9 ЮОф (р0,1), в том числе только у одного больного бруцеллезом. Таким образом, предлагаемый Способ диагностики иерсиниозов неуступает йоэффективности прототипу и позволяет под-" твердить диагноз у 84,6% больных иерсиниозами (иерсиниозом и псевдотуберкулезом),П р и м е р 1. Готовят рабочее разведе-ние протеинового антигена - 12,5 кмг/мл,(по белку) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 8,0, Сенсибилизацию планшетпротеиновым антигеном проводят в течение16 ч при 4 С, После инкубации планшетытщательно отмывают от несвязавшегося антигена забуференным физиологическим"раствором с твином. Затем в 8 лунок полистироловых планшет вносят гипериммунную кроличью сыворотку к 1, Сыворотку получают путем внутривенной 3-х кратной иммунизацией животных спиртовым анти- геном, Сыворотку вносят в разведении 1;400 по 100 мкл в лунку. В качестве контроля в парные лунки вносят пул иэ 10 нормальных кроличьих сывороток в том же разведении, Инкубируют в течение 1 часа1767435 Формула и зоб рете н и я Способ иммуноферментной диагностики иерсиниоэов путем иммобилизации анти- гена на полистирол микрокамер для иммунологических реакций с последующим выявлением антител с помощью ферментнойметки,отличающийся тем,что,с целью ускорения способа, для иммобилизации на полистирол используют протеиновый антиген микробов рода Оегэиа в концентрации 12,5 мкг/мл на карбонатном буфере рН 8,0-9,0 и при повышении специ-. фических антител по сравнению со здоровыми лицами диагностируют иерсиниоз. Группа обследуемых Выявление антиител в иагностическом овне Достоверность раз- личий П е агаемый способ П ототип Р р Абс. Р+рАбс. Больные иерсиониозами Всего: 78Больные другими инфекционными заболеваниями Всего: 178 79,5+4,6 66 84,6 ф 4,2 0,1 18 10,12,2 14 7,9 й 2,0 0,1 Составитель М. МакаренкоРедактор С. Кулакова Техред М,Моргентал Корректор М, Ткач Заказ 3546 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 при температуре 37 С. После отмывки не- связавшихся антител в лунки вносят конъюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченных пероксидазой в рабочем разведении и оставляют при 37 С еще на час, После 5 отмывки планшет в лунки вносят субстратную смесь, состоящую из 10 мг ортофенилендиамина, 0,35 мл 3 перекиси водорода и 25 мл цитратного буфера (рН 5,0), Через 10 минут реакцию останавлива ют добавлением 10 раствора серной кислоты по 50 мкл в лунку. Учет реакции проводят на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного 15 анализа (ЕД ИФА, которые рассчитываются как отношение оптической плотности лунки с гипериммунной кроличьей сывороткой к средней (по двум лункам) оптической плотности лунок с пулом неиммунной кроличьей 20 сыворотки, умноженное на 100. По данным 8 измерений вычисляют среднюю арифметическую и ее ошибку, которые составляют 885+66 ЕД ИФА. Это достоверно выше, чем при дозе сенсибилиэации 6,25 мкг/мл 25 (53036) и при рН комплексующегося буфера 7,0 537 й 46) и 10,0 (644+47).Основное преимущество разработанного способа заключается в уменьшении трудоемкости исследования. Так, при ис пользовании традиционного способа диагностики иерсиниозов (прототипа) 256 исследуемых сывороток последовательно анализировали на наличие антител к типо- специфическим антигенам каждого из 8 35 известных возбудителей заболевания. Всего было проведено 2048 исследований с общей затратой времени 16-20 ч, Проведение работы потребовало использова 40 ния 45 планшет для иммунологических реакций (одноразовых), 224 мг хромогена - ортофенилендиамина и 560 мл конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулинам человека.Применение предлагаемого способа с использованием одной тест-системы, выявляющей антитела к иерсиниям независимо от вида и серотипа возбудителя, позволяет сократить в 8 раз объем исследований, время анализа, расход реактивов и полистироловых планшет без ущерба для эффективности диагностики. Кроме этого, сокращение времени проведения анализа уменьшаетдлительность контактирования с хромогеном-ортофенилендиамином, который является потенциальным канцерогеном, что также является положительной стороной предлагаемого способа,Изобретение может найти применение в производстве диагностических препаратов, в лабораторной диагностике иерсиниозов, в научно-исследовательской работе,