Способ обнаружения антител к вич-2

(55 6 01 й 33 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКПРИ ГКНТ СССР 1 ТИЯМ; д:,ЯЬ) И Е ТЕНИЯ ОБ ПАТЕНТУ М 24СН)е. Бо Свенон и Петер., В 1 о(ес 1)п ерхолм, ЛарсХораль (5 Е) оду, 1986, М вирусология. Су ют антигенный птид Изобретение относится к синтетическому пептидному антигену, последовательность которого соответствует фрагменту иммунологически важного протеина вируса ВИЧ, Этот пептид полезен как диагностик для определения присутствия антител к вирусу ВИЧ, Этот пептид может быть также полезен как иммуноген в композициях, служащих для определения выработки антител против ВИЧу животных, включая человека. Синдром приобретенного иммунодефицита /СПИД/ является самой важной проблемой всемирного эдравоохранения. Этиологический агент СПИДа назвали ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), название, которое относится к группе очень близких вирусов, которые раньше называли НТ 1 )/ - 111, 1.АЧ и АЯС (теперь общее название ВИЧ),(21) 4355880/13(57) Использованиизобретения; пЬлу отес 1)пооду, 1986, 4. р. РУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К формулы Х-Азрп-А 1 а-Агдео-Азп-ЯегТгру-Суз-Аа-Р 1)е-Агд п-Ча 1-Суз-Н 1 зТЬ г-Т 1)г-)/а,1-Р го-Тгр-Уа 1-Азп-У-Е, соответствующий области глюкопротеида др 41, кодированой геном оболочки ВИЧ. Пептид является иммунологически реакционноспособным со специфическими антителами ВИЧи используется для обнаружения заражения ВИЧили его воздействия и в композициях для стимулирования получения антител против ВИЧу животных и человека. 1 табл. Относящиеся к СПИДУ комплексы из Северной Америки, Западной Европы и Центральной Африки обычно имеют одинаковые биологические свойства и антигенно перекрестно-реагирующие протеины. Однако генетические исследования показали различия в нуклеотидной последовательности геномов изолятов североамериканского и африканского ВИЧ. Кроме того, описаны небольшие различия в нуклеотидных последовательностях в изолятах различных ВИЧ из Америки.Недавно выделены несколько вирусов, генетически и структурно относящихся к ВИЧ. Эти вирусы, которые генетически и иммунологически напоминают ВИЧ, выделили иэ макак резус /Масаса гпсат(а/. которые болели СПИДом. подобным заболеванию здоровых диких африканских зеленых мартышек /Сегсор)(1)есоз зр./, Ви 1825424русы, которые раньше назвали как ЪТЧЧ 111 АОН изолят африканских зеленых мартышек и ЯТЧЧМАС /изолят макаки/, теперь известны как ВИО /вирус иммунодефицита обезьяны/,Новый вирус человека. названный НТ Ч-Ч, выделили у кажущихся здоровыми людей в Западной Африке. Этот вирус, который вырабатывает в инфицированных клетках частицы типа ретровируса, имеет характеристики роста, основные вирусные протеины, аналогичные этим параметрам у НТ Ч/1 АЧ и ЯТ 1 Ч, Серологические данные показывают, что НТ Ч-Ч имеет больше сходства с ЯТ 1 ЧАСМ, чем с прототипом НТ Ч/ АЧ, выделенным из больных в Европе и США.Африканские больные.Несмотря на то, что у пациентов наблюдаются классические симптомы СПИДа, в их сыворотке нельзя обнаружить заметные титры антител к известным антигенам ВИЧ. Однако ретровирус, первоначально назвж ный 1 АЧи структурно и биологически относящийся к ВИЧ, выделили у пациентов в Западной Африке, Западноафриканский вирус, который в настоящее время выделен у ряда больных СПИДом, АРС и не имеющих симптомов какого-либо заболевания, теперь известен как ВИЧдля того, чтобы отличить его от ВИЧ /теперь ВИЧ/, ранее индентифицированного как этиологический агент СПИДа в Европе, Северной Америке и Центральной Америке.Также как НТ Ч-Ч ВИЧближе к ВИО, чем к ВИЧ. Однако ВИЧи НТ Ч-Ч не являются одним и тем же вирусом, поскольку ВИЧубивает Т-хелперы человека, зараженные 1 п ч 11 го, а НТ Ч-Ч - нет.Полная нуклеотидная последовательйость ВИЧ, которая была недавно опубликована, показывает гомологию генетической последовательности с ВИЧтолько 42 . Значительные различия имеются в большинстве вирусных белков, но наиболее выражены в глюкопротеидах, кодированных генами оболочки ВИЧи ВИЧ, Фактически, по-видимому, глюкопротеиды оболочки В ИЧболее тесно связаны с глюкопротеидами ВИО, чем с ВИЧ.Исследование отсутствия серологИческой перекрестной реактивности между ВИЧи ВИЧимеет очень большое значение при разработке диагностических тестов на заражение ВИЧи вакцин против ВИЧ, Исследования показали, что больные, зараженные ВИЧ, не выявляются с помощь геполпгических тестов, определя 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ющих ВИЧ. Любые перекрестные реакции, которые наблюдали между этими двумя вирусами, обычно осуществляются эа счет антител, которые вступают в реакцию с общими эпитопами на основных протеинах ядра, Р 25 и Р 26, кодированных геном дад этих двух вирусов, Антитела к глюкопротеидам вирусной оболочки Р 120 и Р 41 и их предшественнику Р 160 не вступают в перекрестную реакцию с глюкопротеидами оболочки ВИЧ,Имеющиеся в настоящее время тесты для обнаружения ВИЧ, которые, в основном, основаны на обнаружении антител к глюкопротеидам ВИЧ, например др 160. др 120 и др 41 и их частям, нельзя использовать для обнаружения антител к ВИЧв пробах для целей диагноза и скрининга, Таким образом, специфичные антигены ВИЧдолжны включаться с антигенами ВИЧв реагенты для эффективного диагностического и терапевтического применения,Разработанные для обнаружения заражения ВИЧспособы в общем случае измеряют воздействие на вирус обнаружением и количественной оценкой антител к антигенам ВИЧв крови, сыворотке и полученных иэ крови продуктах, Такие тесты можно использовать для диагностики СПИДа и АРС /СПИД-связанный комплекс/ и для скрининга крови и препаратов крови для предыдущего воздействия вируса ВИЧ.Существующие попытки диагностировать заражение ВИЧи фильтровать кровь для воздействия ВИЧвключают методы иммунной пробы, связанной с ферментом /Е.1 ЯА/, предназначенные для определения присутствия антител к иммуногенным компонентам ВИЧв контрольной пробе. Другие способы могут использовать методы с фильтровальной бумагой Вестерна, предназначенные для определения специфических антител ВИЧв контрольных пробах, В общем случае, можно применить почти все известные иммунопробы, такие как радиоиммунопробы, используя специальные реагенты для обнаружения ВИЧи антител к нему.Источники антигенов для этих испытаний могут включать п 1 ег а 1 а протеины ВИЧ, полученные из линии Т-клеток, зараженных ВИЧ, и антигены, полученные методом рекомбинантной ДНК. Однако использование антигенов, полученных иэ этих источников, имеет значительные недостатки.Получение самого ВИЧв непрерывных линиях клеток должно осуществлятьсяв лабораториях повышенного риска /загрязнение РЗ/ иэ-эа опасности для исследователей, которые могут подвергнуться воздействию этого вируса; кроме того, поскольку сообщается о ложных положительных и отрицательных результатах притестах ЕЕ 15 А при использовании антигенов ВИЧцелого вируса, полученных иэ линий клеток, вероятно, такие недостоверные результаты будут получаться с полученными с клетки ВИЧантигенами. Анализ пятен Вестерна для обнаружения ВИЧс применением электрофильтруемых целых вирусных антигенов, может обеспечить большую специфичность, но является более трудоемким и длительным,чем тесты ЕЯА. Более того, поскольку вырабатывающие ВИЧклетки имеют человеческое происхождение, препарат вирусного антигена, полученного из этих линий клеток. если не подвергается очень тщательной очистке. может загрязняться обычными клеточными антигенами, такими как антигены НЮ, что может вызвать ложные положительные реакции в тесте ЕОЯА.Исчерпывающая очистка вирусных ан-тигенов из линий клеток может также разрушить иммуногенность иммунологически важных протеинов или иначе неактивных 30 антигенов, вырабатывая тем самым реагенты, которые приводят к ложным отрицательным реакциям. Кроме того, ложные отрицательные реакции, использующие антигены, полученные из живого вируса, могут 35 иметь место из-за стерического препятствия, в результате которого антитела не могут реагировать с их специфическими антигенами, так как реакция блокируется наличием других антигенов и антител в ре акционной смеси.Тесты ЕЕ 1 ЯА для обнаружения ВИЧ могут также испольэовать иммунологически важные вирусные протеины, полученные клонированием частей генома ВИЧв бак терии. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность ВИЧс кодированием генов для различных ВИЧпротеинов, определяемым сравнением с гомологичными ВИЧгенами, Глюкопротеиды вирусной оболочки и протеины ядра соответственно, кодированные епч- и оаягенами ВИЧ, по-видимому являются анти- генами. распознаваемыми антителами в сыворотке больных, зараженных ВИЧ.Иммунологически важные антигеныВИЧ, такие как ор 160 и его продукты расщепления ор 120 и ор 41, которые присутствуют в вирусной оболочке, можно получить Э клонированием частей генома ВИЧв различных системах экспрессии, таких как бактерия, дрожжи или вирусы вакцины. Такие рекомбинантные антигены можно использовать для диагноза и как потенциальные вакцинные композиции. как было сделано для протеинов ВИЧ/1,2/, Однако антигены ВИЧ, полученные методами рекомбинантной ДНК, все еще требуют опустошающей очистки во избежание ложных положительных реакций в ЕЕ 1 ЯА из-за реактивности любого антитела к антигенам в системе экспрессии, которые могут загрязнять препарат антигена ВИЧТакже, денатурация антигенов ВИЧво время очистки может разрушать важную антигенную активность.Хотя антигены ВИЧ, полученные рекомбинантными методами, могут быть улучшением по сравнению с антигенами, полученными иэ зараженных вирусом клеточных культур;рекомбинантные протеины могут все еще обеспечивать реагенты. которые позволяют как можно более точно определять диагноз, Из-эа характера болезни и необходимости точных результатов необходимо разработать другие реагенты для достижения 1006 точности при диагнозе ВИЧ.Протеиновые антигены содержат ряд эпитопов или антигенных детерминант, которые являются областями протеинов, которые включают сайты связи для специфических антител. В общем случае, протеиновые антигены содержат 5-10 эпитоп, каждая иэ которых содержит последовательность 6-8 аминокислот, Эпитопы могут быть непрерывными, в которых 6-8 аминокислот присутствуют в линейной последовательности, или прерывистыми, в которых аминокислоты, которые образуют эпитоп, сведены вместе трехмерной укладкой протеина. Даже когда эпитоп состоит только из относительно небольшого числа аминокислот, его реактивность с антителом подвергается воздействию аминокислот в протеине, который окружает эпитоп.Исследованиям, целью которых было вычерчивание антигенных сайтов или эпитопов протеинов, помогло применение синтетических пептидов, соответствующих различным областям представляющих интерес протеинов.В дополнение к их полезности в исследованиях вычерченных эпитопов, синтетические пептиды. если включают большинство антигенных детерминант протеина, имеют потенциал как иммуногенныекомпозиции, включая вакцины, и диагностические реагенты, Антигены синтетического пептида имеют несколько достоинств по отношению к получению спецйфического антитела и реактивности. Точную последовательность синтезированного пептида можно выбрать из последовательности аминокислот, фактически определенной из аминокислотной последовательности протеина или предсказанной иэ кодирования ДНК-последовательности для протеина. Использование специфических синтетических пептидов исключает необходимость применения протеина полной длины в получении специфических антител или в их испытаниях. Далее, методы синтеза твердофазного пептида Меррифельда и его сотрудников позволяют химически получить, по существу неограниченные количества представляющего интерес синтетического пептида, Дополнительные преимущества такого способа заключаются в доступности автоматических синтезаторов пептида.Синтетические пептидные антигены, соответствующие областями иммунологически важнЫх протеинов ВИЧ, найдут немедленное применение в диагностических методах, а также в качестве возможных вакцин для ВИЧ,В соответствии с изобретением получают новый синтетический пептид, соответствующий антигенному ВИЧйротеину, полезный в выбранных диагностических методах для обнаружения заражений ВИЧ.Новый синтетический пептидный антиген, соответствующий части глюкопротеида др 41, кодированной епч-геном ВИЧ, обнаружен в настоящее время. Этот пептид полезен для диагностики СПИДа, вызванного заражением ВИЧу подозреваемых лиц и в методах скрининга для воздействия ВИЧ в крови и полученных из крови препаратах с высокой степенью надежности и специфичности.Этот пептид можно использовать в способах обнаружения антител к ВИЧв пробах. Эти способы включают контактирование пробы с пептидными антигенами при условиях, которые позволяют иммунологическому комплексу образовываться между пептидом и любыми специфичными к ВИЧантителами, которые могут присутствовать в данной пробе, Измерение формирования комплекса, если таковое имеет место, при помощи подходящих детекторов, указывает наличие или отсутствие антител к ВИЧв пробе.Новый пептид может также быть поле, зен как иммуноген в вакцинных композици-ях для иммунизации против зараженийВИЧили для получения в животных ВИЧ 5 специфических антител против антигеновВИЧ,Изобретение описывает пептид, соответствующий области глюкопротеидатрансмембранной оболочки ор 41 ВИЧ, ко 100 торый синтезирован и проверен на иммунореактивность к ВИЧпозитивнымсывороточным пробам, Новый пептид полезен в испытаниях для диагностики эараже 15ния ВИЧили для предварительноговоздействия на вирус и как иммуноген вкомпозициях для стимулирования получения антител против ВИЧв животных,включая человека. Этот охватываемый изобретением пептид включает аминокислотную последовательность. содержащую поменьшей один непрерывный /линейный/эпитоп, реактивный со специфическими антителами ВИЧ,Таким образом, изобретение охватывает иммунологически реактивный пептид иего функционально эквивалентные варианты, которые не влияют в заметной степенина антигенные свойства пептида, соответст 30 вующего области ор 41, кодированной епчгеном ВИЧ. Пептид был синтезирован известными методами синтеза твердофазного пептида.Этот синтез также позволяет одной или 354045 50 55 двум аминокислотам, не соответствующим последовательности исходного и ротеина, присоединяться к амино- или карбоксильным окончаниям пептида. Такие дополнительные аминокислоты полезны для связипептида с другим пептидом, с большим протеином носителя или с носителем. Аминокислоты, полезные для этих целей,включают тироэин, лизин, глутаминовуюкислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин иих производные. Можно использовать дополнительные способы модификации протеина, например ИН - ацетилирование илиамидирование СООН-конца для обеспечения дополнительных средств связи пептидас другой молекулой протеина или пептидаили с носителем.Последовательность нового пептидаописана ниже.Н 2-41 А 5.Х-Азрп-А 1 а-Агцео-Азп-Бег-Тгру-Суз-А 1 а- РЬе-Агц-С а-Ча 1-Суз-Н 1 з-ТЬг-Т 1 тгЧа 1-Рго-Тгр-Ча 1-Азп-У-Е,где Х - водород аминоконцевой МН 2-группыпептида или дополнительная аминокислота, 1825424 10связанная с аминоконцевой ЙН 2-группой пептида, причем эта дополнительная аминокислота оыбираетсл длл облегчения связи пептида с протеином носителя; У - отсутствует или Суз; 2 - ОН или НН 2,Пептид Н 2-41 А 5 кодируется нуклеотидной последовательностью генома ВИЧ, охватывающей пары азотистых оснований /Ьр/ 7908-7978, которая находится в области кодирования генов оболочки для цр 41. Пептид Н 2 - 41 А 5, где Х-Н: У-Сув; 2-ОН, предпочтителен,Этот пептид можно использовать в способах обнаружения антител к связанным с ВИЧили ВИЧантигенам, Предпочтительно, методы, которые используют пептид для обнаружения наличия специфических антител к ВИЧв пробе. включают контактирование пробы с пептидом при условиях. позооляющих образование иммунологического комплекса между антигеном пептида и любыми антителами к ВИ 4-2, которые могут присутствовать о пробе, Формирование иммунологического комплекса. если таковой существует, показывает наличие антител к ВИЧо пробе и затем этот комплекс обнаруживаетсл и измеряется пригодными средствами.Такие методы включают, среди других, гомогенные и гетерогенные связанные иммунопробы, такие как радиоиммунопробы /РИП/, метод иммуной пробы, свлэанной с Ферментом /ЕЕЪА/. и анализ пятен Вестерн иа. Далее, протоколы испытаний, ищи зующие новый пептид, позволяют поооести исследования, сраонительные и контрольные связи.Пептид может быть меченым /генерирующим сигнал/ или немеченым о зависимости от типа используемой пробы. Метки, которые могут быть связаны с пептидами, относятся к разряду известных в технике и включают, среди прочих ферменты, радиоизотопы, фторогенные или хромогенные вещества, коферменты, биотин/авидин, коллоидное золото и магнитные частицы, Модификация нового пептида позволяет осуществлять связь известными средствами с протеинами или пептидами-носителями, или с известными носителями, например полистироловые или поливиниловые микротитровальные пластины, стеклянные трубки или стеклянная дробь, и хроматографическими носителями, такими как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы и кремнезем.Предпочтительными известными методами анализа, особенно для крупномасш 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 табного клинического скрининга крови и полученных из крови препаратов, а также сыворотки, являются методы ЕЕЯА и пятен Вестерна, В частности, предпочтительным является метод Е 115 А. Испытания Е 15 А, использующие пептид Н 2-41 А 5. описанный выше. основаны на методах, используемых в настоящее время с полученными из клетки человека или иэ рекомбинантной ДНК ВИЧ протеинами или их частями в качестве антигеноо. Для использования в качестве реагентов о этих пробах пептид Н 2-4 А 5 обычно связывают с внутренней поверхностью микротитровальной лунки. Пептид может быть прямо связан с микротитровальной лункой, Однако установлено, что максимальную связь пептида с лунками можно получитьб предварительной обработкой лунок полилиэином до добавления пептида.Пептид Н 2 - 41 А 5 может быть ковалентно соединен известными методами с протеином-носителем, таким как альбумин бычьей сыворотки, используемым для покрытия лунок, Обычно пептид используется в концентрации 10-100 мг/мл для покрытия.Пробы, которые должны испытываться на антитела к ВИЧ, затем вводят в покрытые пептидом лунки, где образуется иммунологический комплекс, если в пробе присутствуют антитела к ВИЧ, Длл того, чтобы помочь обнаружить образование комплекса, можно ввести средства генерирования сигнала. Обнаруживаемый сигнал вырабатывается. если в пробе имеются специфические антитела к ВИЧ,Изобретение иллюстрируется следующими специальными примерами, которые ни о коем слу,ае не ограничивают объем защиты изобретения.П р и м е р 1. Для синтеза пептида Н 2-41 А 5 использовали синтезатор пептида 430 А фирмы "Эпплайд биосистема". В синтезе использована и-метилбензилгидриламиносмола на твердофазном носителе, Все аминокислоты для использования в синтезе содержали третбутилкарбонильные группы /т-Вос/, защищающие а-ННр-группу. Аминокислоты с реакционноспособными группами с боковой цепью содержали дополнительные защитные группы для предотвращения нежелательнык и ненужных реакций боковой цепи, Отдельные защищенные аминокислоты, и.польэованные для синтеза пептида Н 2-41 А 5, выбирались из следующих (ВосЬ/ОВ 2 /-ОН. ВосеОН 1/2 Н 20, Восуз -/2-С/-ОН (кристаллическая), Вос-Мет-ОН и Вос-Туг-/2-Вг/-ОН, не использовались в синтезепептида Н 2-41 А 5);Аминокислоты, используемые в синтезепептида: Вос-А 1 а-ОНВос-Агд(тоэ) ОНВос-Аэп-ОНВ ос-Азр(0821)-ОНВос-Суэ-(рМе 0821)-ОНВосЬ(0821)-ОНВосц-ОНВ осу-ОНВос-Н 1 э(тоэ)-ОНВос-Е 1 е-ОН 1/2 Н 20Восео-ОН Н 20Восуэ(2-С 1-2)ОН /кристалличВас-Ме 1-ОНВос-РЬе-ОНВос-Рго-ОНВос-Яег-(821)-ОН ОСНАВас-ТЬ(821)-ОНВо:-Тгр /формил/-ОНВ ос-Туг(2-В г)-ОНВ ос-Ча-ОНТоЯ-тозил или р-толуолсульфок0821-бензилоксирМе 0821=п-метил бензилокси2-С 1-2 - карбобензоксихлорид2-Вг- карбобензоксибромид еская/ ислота После завершения синтеза защитные группы удалили из синтезированного пептида и пептйд отщепили от смолы на твердом носителе обработкой и ри 0 С безводной плавиковой кислотой (НГ), используя в качестве удаляющих агентов совместно 10 анизола и 10 диметилсульфида. В качестве дополнительного удалителя добавили 2 ь тиокрезола, так как Н 2-41 А 5 является содержащим цистеин пептидом.После отщепления НГ в пробе промыли под струей Йг с удалением любой остаточной НР при помощи воздействия на пробу вакуума при 0 С, Пептид зкстрагировали из смолы обработкой трифторуксусной кислотой /ТРА/, которую затем удалили испарением при комнатной температуре. После удаления ТРА пептид осадили и промыли безводным простым эфиром.До использования в специальных про бах пептид можно дополнительно очистить, если необходимо, при помощи обращеннофаэовой скоростной жидкостной хроматографии. Очень подходящей колонной для такой очистки служит обращеннофаэовая колонна Чудек С. испЬльзующая для элюирования пептида градиент вода /ТГА/- ацетонитрил /ТРА/,П р и м е р 2. Пептид Н 2 - 41 А 5, имеющийпоследовательность аминокислот Азрп 5 А 1 а-Агд.ео-Аэп-Яег-Тгру-Суз-Аа-РЬеАгдп-Ча-Суз-Н 1 э-ТЛг-ТЬг-Ча-Рго-Тгр-Ча 1-Аэп-Суэ-ОН, синтезировали как описано впримере 1 и использовали в испытанииЕЯА для измерения его иммунологической10 реактивности.На микротитровальные пластины внесли полилиэин в концентрации 1 мг/мл ивыращивали 30 мин, Полилизин затем удалили и в лунки пластин добавили пептидН 2-41 А 5 в концентрации 10 - 100 мг/мл дляпокрытия, После того,как пептид выращивали в лунке в течение времени, достаточногодля связи пептида с лункой, пептидный рас 0 теор удалили и 15 мин добавляли растворглутаральдегида, который стабилиэует присоединение пептида к лункам, Затем раствор глутаральдегида удалили, лункипромыли буферным раствором и добавили25 смесь глицина и альбумина бычьей сыворотки, которая служит для блокировки несвязанных сайтов в лунках и минимизациинеспецифической связи антител в течениесамого испытания Е 11 ЯА. После последней30 операции промывки пластины были готовык применению,Обычная вариация известных методовЕ 1 ЯА использовалась с приготовленнымимикротитровальными пластинами. Пробы35 сыворотки отдельных лиц, разбавленные1:50 в РВЯ /фосфатно-буферный солянойраствор/, содержащем 0,05 оь полиоксизтиленсорбитмонолауарата /Твин 20/ и 1альбумина бычьей сыворотки, вносили в40 каждую лунку и выращивали 90 мин при 37 Сво влажной атмосфере, Разбавленные пробы сыворотки затем удалили из пластин илунки промыли три раза РВЯ, содержащим0.056 Твин 20. В лунки затем добавиликоньюгированное античеловеческое 1 д антитело и выращивали 90 мин. КонъюгироЭванное антитело получали в козле иликролике и специфицировали для человеческих 1 д 6,дМ иммуноглобулиновых легкихцепей или их комбинаций. Предпочтительно, в Е 1.1 ЯА испольэовали связанный с щелочной фосфатазой античеловеческий 1 д 6/иэ ОаЬорайз/, разбавленный 1:500 в РВЯ,содержащем 0,0565 Твин 20 и 1 альбуминабычьей сыворотки. После того,как конъюгант выращивали достаточно времени дляреакции со связанными антителами человека, пластины промыли три раза. Для обнаружения антител к ВИЧв человеческой1825424 13 14 Формула изобретения 30 Иммунореактивность пептида Н 2 - 41 А 5 по отношению к ВИЧ, положительным ВИЧиположительным и отрицательным пробам сыворотки, определенная при помощи методаиммунопробы, связанной с ферментом сыворотке, которая реагирует с пептидом Н 2-41 А 5, использованном как антиген /т,е. положительные реакции/, добавили хромо- генный щелочно-фосфатазный субстрат /таблетки ч. 104 Рогпа Сот/, растворенный в буфере карбонат натрия /МС и подрегулированный до концентрации 1 мг/мл, который был отщеплен ферментом, присоединенным к античеловеческому ц 6 для получения цветного продукта. Желтый- оранжевый - красно-коричневый цвет в каждой лунке, показывающий положительную реакцию, считали э спектрометре при 405 нм для количественной оценки реакции. Спектрометрические отсчеты подстроили для корректировки фоновых реакций,Пептид Н 2 - 41 А 5 использовали в параллельных Е ЯА относительно б сывороточных проб, положительных для антител к ВИЧ, 10 сывороточных проб, положительных для антител к ВИЧ,и 6 отрицательных к ВИЧ/ВИЧсывороток. Как показано в таблицеб/б подтвержденных положительных ВИЧсывороточных проб /100 / прореагировали с пептидом Н 2-41 А 5. Таблица также показывает, что ни одна положительная к ВИЧсывороточная проба и ни одна отрицательная сыворотка не реагировала сН 2-41 А 5.Из приведенных результатов очевидно,что новый синтетический пептид, описан 5 ный Н 2 - 41 А 5, который соответствует области глокопротеида о р 41 ВИЧ,кодированной геном оболочки, явно обеспечивает уникальный реагент для чувствительного и избирательного анализа наприсутствие антител к ВИЧ,Способ обнаружения антител к ВИЧ,включающий проведение иммуноферментного анализа исследуемой пробы с антигеном и последующую оценку образовавшегося иммунного комплекса, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что. с целью повышения чувствительности, в качестве антигена используют полипеитид Х-Азри-Аа-Аго ео-Азп-Зег-Тгру-Сув-Аа-РЬе-Агу иЧа-Суз-Н з-Тпг-ТЬг-Ча 1-Рго-Тгр-Ча-Азп-У Е, где Х - водород аминоконцевой группыпептида или дополнительная аминокислота, связанная с аминоконцевой ИН 2-группой пептида; т - Суз; Е - ОН.1825424 15 16 Продолжение таблицы Составитель С.ВировальТехред М,Моргентал Корректор И.Шмакова Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 Заказ 2235 Тираж Подписное ВНИИХИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., 4/5