Способ определения антител к миокарду

(21) (22) (46) (71) тельс ного здрав (72) С.Н. (53) 4003502(28-127.12,8523.07.88 БюлЦентральнаякая лаборатоуправления поохранениЮ.И.ЗйминМосквина и615,373(0Белгарянрт И.Т. учно-исследовая Четвертого глМинистерстве я СССРА.В.СУС.Е.Тер88.8)А.А., СуТер.арх ко шенк оков А,В.1980, У 6 мп -8 ТЛК ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ ЕМИОКАРДУ(5) Изобретение относится к медици"не, касается диагностики аутоиммун"ного поражения миокарда, Цель изобретения - упрощение способа, Для этого иэ сердечной ткани эмбриона чело"века готовят гомогенат, который фрикционируют методом дифференциальногоцентрифугнрования при 4500050000 об(мин. После обессоливания супернатанта проводят гель-фильтрациюна колонке сефадекса Сдля выделения высокоочищенной белковой Фракциимиокарда, которую помещают в пробир,ки и инкубируют 1,5 ч, затем пятикратно отмывают фосфатным буфером (рН 7,2) и 0,053-ным р-ром Твин, В пробирки после отмывки добавляютд 17.-ный р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА). Контрольную группУ пробирок заполняют только р-ром БСА. Затем вновь проводят инкубацию и отмывку в аналогичных условиях, Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного при трех разведениях сыво" ротки - 1: 10, 1: 100, 1: 1000. В отмытые пробирки опыта и контроля добавляют сыворотку крови кролика с антителами к иммуноглобулинам человека в разведении 1:1000. Вновь проводят инкубацию а и отмывку и вносят сыворотку свиньи с антителами к иммуноглобулинам кро" лика, меченную пероксидазой в разведе- , нии 1:1000. После инкубации и отмывки Ъ в пробирки вносят субстратную систему АВТБ и НО, вновь инкубируют 25 мин, добавляют р-р азида натрия для блокирования цветной реакции, оценивают степень окраски спектрофотометрически при Я = 650 нм. По интенсивности развивающейся цветной реакции твердоФаэным иммунным методом определяют противокардиальные антитела.Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике аутоиймунного поражения миокарда.5Целью изобретения является упрощение способа.Способ осуществляют следующим об"азом.Из сердец 25 эмбрионов человекавозрасте 20-24 недель готовят гомо" 10 енат, который фракционируют методом дифференциального центрифугированияри 45000-50000 об/мин, Необходимаяелковая фракция при данной частотеращения остается в супернатанте, ари большей осаждается на дне пробири вместе с другими белковыми фракиями. После обессоливания супернааита проводят гель-фильтрацию на коонке сефадекса С.для выделения ысокоочищенной белковой фракции миоарда с молекулярной массой 250005000, что соответствует массе клеочных мембран кардиомиоцитов Полу"енный антиген миокарда (белок мембан кардиомиоцитов) имеет морфологиескую (в том числе и антигенную)труктуру, идентичную миокарду взросого человека. Плод считается жизнепособным в возрасте свьппе 28 неель, а к 20 неделе развития уже полостью формируются элементы сердечноосудистой системы, Использование эмбрионального антигенного материала щокарда является наиболее благоприятным, так как миокард эмбриона, зятый сразу после его гибели, ие подвергался воздействию вредных агентов, способных влиять на антигенную структуру кардиомиоцитов, Полученный 40 нтиген миокарда не содержал миогло 5 ин (мол.масса 17600), что было под" гверждено при радиоиммунологическом исследовании с набором антител к миоглобулину Аоппцие Нцс 1 еаге. Для 45 завязывания антигена миокарда с твердой фазой (внутренней поверхностью олистироловой пробирки) в полистиоловые пробирки помещали раствор анТигена миокарда в концентрации 35 мкг/мл, Данная концентрация антигена является наиболее оптимальной, гак как использование концентраций антигена 12,5 мкг/мл и меньше сущестВенно снижает чувствительность способа, тогда как при применении концент 55 рации антигена миокарда 50 мкг/мл и больше заметно не повьппает чувствительность способа, а расход ценного реактива - антигена миокарда - значительно увеличивается, Пробирки инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С во влажной среде, содержащей 5% СОп. При инкубации более 2 ч чувствитель" ность способа повышается незначительно, а при инкубации менее 1 ч отмечено значительное снижение чувствительности метода. Температурный режим и уровень концентрации СО соответствуют внутренней среде живого ор ганизма и наилучшим образом влияют на кислотно-щелочное равновесие используемых растворов.После ннкубации проводят пятикрат ную отмывку фосфатным буфером (рН 7,2) и 0,05 -ным раствором Таиндля уменьшения неспецифического свя " зывания белков, Пять последовательных отмывок достаточно для полного удаления из пробирок реактивов, участ вовавших в предыдущем этапе исследования. После этого в пробирки добавляют 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, обеспечивающего полное закрытие оставшейся свободной поверхности полистирола, способного участвовать в неспецифической сорбции белков. Использование альбумина в концентрации меньше 1% не обеспечивает полного закрытия полистироловой поверхности, что в значительной мере снижает специфичность способа, а при применении концентрации альбумина .г . больше 1,5 существенно не влияет на специфичность способа и приводит к большему расходу реактива (альбумина). Эти данные получили при использовании альбумина в интервалах концентрации от 0,05 до 2 , Параллельно формируют контрольную группу пробирок, численно равную опытной, которые заполняют только указанным раствором альбумина, Все пробирки инкубируют и отмывают в указанных условиях. Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного, Формируя три разведения сыворотки 1:1 О, 1:100 и 1:1000, которые вносят в три пробирки из контрольной и три пробирки из опытнойгрупп, создавая серию из шести пробирок, соответствующую каждому больному, Указанные пробирки инкубируют и отмывают в указанных условиях.В отмытые пробирки добавляли сыворотку крови кролика, содержащую антитела к иммуноглобулинам человека, в разведении 1:1000. Данное разведение сыво з14116724ротки является наиболее оптимальным ментного способа на наличие антителдля увеличения чувствительности и спе- к миокарду, В качестве контроля исцифичности способа, Инкубацию н от- пользовали сыворотку, полученную иэмывку проводят в указанных условиях, крови здорового человека. В реэульПосле этого в пробирки вносят сы- тате проведенного исследования полуворотку свиньи, содержащую антитела к чили следующие данные: индекс абсорбиммуноглобулинам кролика, меченую ции в опыте составил 0,99, в контпероксидазой, в разведении 1:1000. роле - 0,44. Данные позволяют гово-Данное разведение сыворотки обеспечн Рить о наличии антител к миокарду ввает избыточноесодержание антител, сыворотке крови иммунизированногомеченных пероксидаэой, что необходи- , кролика, тогда как в сыворотке конт"мо для следующего этапа способа. Рольного животного антител к миокарПосле инкубации и отмывки в ука- ду не выявили,занных условиях в цробирки вносят 15 П р и м е р 2. Исследовали сывосубстратную систему, состоящую из ротку больного через 20 дней послеАВТЯ и НеО (АВТ - 2,2-аэидопи" операции на сердце (комиссуротомии),этилбентиаэолинсульфоновой кислоты), по поводу порока сердца (митралъногоПроводят инкубацию при комнатной тем- стеноза) В постоперационном периодепературе в течение 25-20 мин, В те У больного развился постпернкардиочение этого времени цветная реакция томический синдром, в патогенезе кодостигает достаточной для измерения торого антитела к миокарду играютинтенсивности. После этого в пробир- ,ведущую роль. В результате исследоваки добавляют раствор азида натрия ния при помощи иммуноферментного спо"для блокирования цветной реаяции,Сте" 2 ь соба полУчены данные: индекс абсорб-.пень окраски оценивали прн спектрофо- ции в опыте (сыворотка. больного)тометрии при длине волны 650 нм. .;: 0,89, а в контроле - 054, результаВолновые параметры подобраны для ис- ты исследования указывают на наличиепользования этой ферментной системы, антител к миокарду в сыворотке болв-,Степень окраски в каждой пробирке из 30 ного. На основании клинических симпопытной серии и соответствующей нро- томов заболевания, а также данных,бирке из контрольной серии характе- полученных при помощи иммуноферментриэовали индексом абсорбции, который ного способа, больному был поставленвычисляли по формуле диагноз постперикардиотомическогоОП - ОПЗБ синдрома аутонммунной природы и проОП веден курс иммуностатической терао.пии с положительным клинико-лабора.где ИА - индекс абсорбции; торным эффектомОП - показатель оптической плот- , Эффективность предлагаемого спосоиности в опытнои серии про ба определения антител к миокардубирок; в сыворотке крови больных состоит вОП- показатель оптической плот- том, что он обладает специфичностью,ности к контрольной серии для исследования достаточно наличиясыворотки больного, что исключаетОбследовали 108 доноров. Антитела 4 проведение биопсии миокарда и упроща 5к миокарду диагностируют при значениях индекса абсорбции больше 0,75,Антитела к миокарду не выявляют при ф о р м у л а и з о б р е т е н и язначениях индекса абсорбции меньше0,37. Результаты считали недостовер 50 Способ определения антител к миоными, если индекс абсорбции находил- карду, включающий выделение кардися в интервале 0,37"0,75. ального антнгена и добавление его кисследуемой сыворотке с последующимП р и м е р .1. Кролика иммуни- определением антител в иммунологичес"зируют очищенным антигеном миокарда, 55 ких реакциях, о т л и ч а ю щ и й -выделенным в указанных условиях, пос- с я тем, что, с целью упрощения споле чего у него забирают сыворотку соба, кардиальный антиген выделяюткрови, Полученную от кролика сыворот- из эмбриональной сердечной ткани чеку исследовали при помощи иммунофер- ловека с помощью гель-хроматографии,1411672 муноферментным методом по.интенсивности развивающейся цветной реакции. а определение противокардиальных антител осуществляют твердофазным имСоставитель В,ЛитовченкоТехред Л.Олийнык Корректор А,Обручар Редактор А.Ворович Заказ 3649/41 тираж а 47 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Иосква, Ж, Раушская наб д, 4/5Ф Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4