Способ получения эхинококкового диагностикума

/5 ОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРМРИ ГКНТ СССР(56) Авторское свидетельство СССРМв 1363564, кл. А 61 К 39/00, 0 01 й 33 3,1985.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭХИНОКОККОВОГО ДИАГНОСТИКУМА(57) Использование: биотехнология, производство препаратов для серологической диагностики эхинококоза у людей и с/хживотных, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума,Сущность изобретения; для повышения точности диагностики выделяют собственнопаразитарные антигены, практически не соИзобретение относится к биотехнологии, в частности к производству препаратов для серологической диагностики эхинокок- коза у людей и с/х животных.Наиболее близким является способ получения эхинококкового диагностикума для Ифа (авт,св. СССР М 1363564 А 1, А 61 К 39/00, 6 01 И 33/53, 1985). Способ включает в себя сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, ее концентрирование на лиофильной установке, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование надосадочной жидкости комбинацией гель- фильтрации на сефадексе (от Гдо Г)(51)5 О 01 й 33/53, А 61 К 39/00 держащие белки хозяина и перекрестнореагирующих антигенов паразитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции. Способ включает сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование антигена из супернатанта. Лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лиофилизат растворяют в физиологическом растворе при весовом соотношении 0,1-0,2;1,2-2,4, центрифугирование осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием 10 О-ного додецилсульфата натрия и элюируют антиген с молекулярной массой 300 к 9 5 мМ растворов бикарбоната натрия с 0,1%-ным додецилсульфатом натрия,и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- сефадексе А. Иммунологически активные фракции, полученные таким способом, не содержат мешающих проведению ИФ реакции перекрестно-реагирующих антигенов,Цель изобретения - повышение точности диагностики эхинококкоза в РНГА,Цель достигается путем выделения собственно паразитарных, практически не содержащих белков хозяина и перекрестнореагирующих антигенов параэитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции.Для этого неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости овец в процесе еезамораживания, оттаивания, концентрирования (лиофилизированную эхинококковую жидкость растворяют в физ. растворе из расчета 0,1-0,2 г лиофилиэата на 1,2-2,4 г физ,раствора), выпадают в осадок и удаляются центрифугированием (20-30 мин при 6000-8000 об/мин), а супернатант фракционируют проведением аналитического гельэлектрофореза. Выделение целевого йродукта с мол,массой 330 кд и более осуществляют методом препаративного гельэлектрофореза с использованием 10;-ного додецилсульфата натрия (при этом используют гель 7,5,-ной концентрации). Элюирование белка проводят 5 мМ ИаНСОз,Изобретение иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1. Выполнение способа, Проводят сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, после замооаживания и оттаивания жидкость лиофилизируют в течение 22-24 ч (время необходимое для полного высыхания эхинококковой жидкости), Лиофилизат в дальнейшем растворяют в физиологическом растворе из расчета 0,1-0,2 г на 1,2-2,4 г физ. раствора, после чего концентрат центрифугируют 20-30 мин при 6000-8000 об/мин осадок отбрасывают, а супернатант фракционируют методом гель-электрофореза с использованием 10 -ного додецилсульфата натрия. Количество материала, фракционируемого в одном опыте, составляет до 10 мг белка на 1 см поверхности геля. При проведении препаративного гель-электрофореза используют 7,5%-ную конечную концентрацию акриламида для разделяющего геля. При анализе белкового спектра эхинококковой жидкости выявляют 8 основных белковых фракций с мол.массой от 14 кддо 330 кд и более. Фракции выделяют путем элюирования 5 мМ ИаНСОз, содержащего 0,1- ный додецилсульфат натрия. Для полной элюции выдерживают кусочек геля в этом растворе при перемешивании 12 ч при 37 С, От геля освобождаются путем продавливания через шприц с владипором М 5. В каждой выделенной таким образом фракции определяют содержание белка методом Лаури и сорбируют на эритроцитах барана по общепринятой методике.,П р и м е р 2. Определение оптимального времени, необходимого для полного высыхания эхинококковой жидкости и эхинококковых оболочек приведено в табл.1,Из таблицы видно, что сушка эхинококковой жидкости менее 22 ч недостаточна, так как не происходит полного высыхания препарата, также нет смысла сушить более 5 10 15 20 25 30 35 40 50 24 ч, ибо 24 ч достаточно для полного высыхания эхинококковой жидкости.П р и м е р 3, Подбор оптимального количества физ, оаствора и лиофилизата, необходимого для получения требуемой концентрации белка в растворе и достаточно полного растворения лиофилизата, приведен в табл,2,Количество материала, фракционируемого в одном опыте, должно составлять 0,1-0,2 г, а минимальное количество физ. раствора, в котором достаточно полно растворяется лиофилизат, составляет 1,2-2,4 г. Концентрат при этом содержит необходимую для фореза концентрацию белка - 9-10 мг,П р и м е р 4, Параметры очистки концентрата от неустойчивых компонентов эхинококковой жидкости центрифугированием приведены в табл.3.Из таблицы видно, что оптимальными параметрами центрифугирования, при которых происходит 100 ф-ная очистка от неустойчивых компонентов эхинококковой жидкости, является 20-30 мин при 6-8 тыс. об/мин,П р и м е р 5. Иммунологическую активность каждой фракции проверяют в РНГА (табл.4).Результаты РНГА с эхинококковыми сыворотками показывают, что фракции с мол.массой ниже 100 кд являются непригодными в качестве диагностикума, тогда как фракции, элюируемые с мол.массой 330 кд и более, обладают высосай точностью диагностики, Иммунологически активные компоненты эхинококковой жидкости распределяются в 1 фракции. РТПГА в кон-. центрации Аг 10 мкг/мл 1 фр. затормозила на 5 разведений (снижала титр от 40960 до 2560).Чувствительность и специфичность диагностикума на основе 1 фр. определяют в РНГА путем сопоставления данных РНГА с коммерческим диагностикумом, полученных при исследовании сывороток крови больных различными паразитарными заболеваниями (аскаридоз, трихинеллез, геминолепидоз) табл.5, 6; Таким образом, наиболее чувствительным и специфичным диагностикумом в РНГА при эхинококкозе является часть полученной методом препаративного гельэлектрофореза высокомолекулярной фракции эхинококковой жидкости (330 кд и более).В полученном данным способом препарате не содержится белков хозяина (овцы), поэтому он может быть применен в качестве1763985 Таблица 1 аблица 2 универсального диагностикума при эхинококкозе животных и человека. Формула изобретенияСпособ получения эхинококкового диагностикума, включающий сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование антигена из супернатанта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума, лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лиофилизат растворяют в физиологическом 5 растворе при массовом соотношении 0,10,2:1,2-2,4, центрифугирован ие осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием 10 10 ододецилсульфата натрия и элюируют антиген с мол.м, 330 кД 5 мМ раствором бикарбоната натрия с 0,1% додецилсульфатом натрия.1763985 Таблица 3 блиц Таблица зультаты сравнительного изучения чувствительности диагностикума на основе очищенной 1 белковой фракции, мол. масса которой 330 кд и болееТаблица бучения специфичности диагностикума на основе очищенфракции,мол.масса которой 330 кд и более зультаты сравнительного ной 1 белковоПроизводственно-издательский комбинат "Патент"г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 аказ 3454 Тираж ВНИИПИ Государственного комите 113035, Москва, Подписноепо изобретениям и открытиям при ГКНТ С