Среда для быстрой дифференциации токсинообразующих грибов

Союз Сфветскик Социалистических РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТРРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ц 870429(22) Заявлено 141279 (21) 2851676/30-15 Р 1)м, клз С 12 й 1/14 с присоединением заявки Нов Государственный комитет СССР по делам изобретений н открьнй(53) УДК 576 8095 3(088 8) Дата опубликования описания 071031(72) Автор изобретеии С.Н.Харченк аинская ордена Трудового Красного сельскохозяйственная академи(71) Заявитель Я ВЫСТРОИ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ОКСИНООБРАЗУЮЩИХ ГРИБОВ 154) СРЕД Изобретение относится к области микотоксикологии и может быть использовано при разработке способов определения пораженности кормов и продуктов питания определенными видами токсинообразующих грибов - возбудителей алнментарных микотоксикозов че" ловека и сельскохозяйственных живот-, )йи, а также для ранней и быстрой идентификации образуемых микромицетами токсинов.Предлагаемая среда может найти применение не только для выявления грибов, продуцирующих микотоксин коевую кислоту, но и для дифференциа ции этой группы грибов,от сопутст- . вующих микроорганизмов, населяющих грубые корма и другие пищевые продук(тыеизвестна среда для быстрой иден тиикации и определения количества А.Г 1 агцв и родственных организмов следующего состава,: 1,5 триптона, 1,0.дрожжевого экстракта; 0,05 цитрата железа, 1,5 агара на которой 25 по ярко желто-оранжевой пигментации колоний и среды отделяют афлатоксинобраэующие ютаммы грибов от беспигментных сопутствующих микроорганизмов (11. 30 Однако образуемая по данной среде устойчивая характерная для токсических штаммов аспергиллов желтооранжевая пигментация не всегда является диагностическим признаком.Подобную пигментацию колоний образу-ют во время роста на ней виды А зц 1-рНцгець, А.вс 1 егос 1 огцщ, А.йНов 11,которые как продуценты афлатоксиновне известны.Кроме того, естественный компонентв данной среде - дрожжевой экстрактможет менять свой химический составв зависимости от способа приготовления, условий и сроков хранения ит.д. Поэтому рассматриваемую средуследует отнести в группу полусинтетических сред неопределенного сос"тава, для которых присущ один общий недостаток: на них повторностьодинаковых условий для культивирования грибов часто бывает труднодостигаема.Известна также среда Чапека, имеющая следующий состав, г/л: глюкозаили сахароза 20-30; МайОк 2"3,КНР 04 0,8-1,2; Н 950 7 НО 0,5-0,7,КС О, 5-0,8 Ге 500,01-0,02; дистиллированная вода до 1 л, агарагар 15-20 21, 8704290,8-1,2 0,5-0,7 0,5".0,8 Это одна из часто применяемыхсинтетических сред для выращиваниямикроскопических грибов, Однако ввиду ее универсальности она не можетбыть использована для дифференциации отдельных видов или групп микромицетов, в том числе продуцентовмикотоксинов.Целью изобретения является быстрая дифференциация токсинообраэующих.грибов, продуцирующих коевую кислоту.Поставленная цель достигается тем,что в среде Чапека увеличено содержание углеводов, а также дополнительновведены лимонная кислота и хлорноежелезо при следующем соотношении компонентов, г/л:Сахароза или глюкоза 50,0-100,0Натрий азотнокислый 2,0-3,0Калий фосфорнокислыйодноэамещенныйМагний сернокислыйКалий хлористыйЖелезо эернокислоезакисное 0,01-0,02Железо хлорное 1,2-1,8Лимонная кислота 0,3-1,0Агар-агар 15-20Водадистиллированная До 1 лВ процессе приготовления средыкомпоненты растворяют в такой последовательности: первыми растворяютв дистиллированной воде минеральныесоли (ИаМО, КНРО 4, И 9504 .7 НО, КС 1)затем лимонную кислоту, Ге 50( иГеС 13, последней - сахарозу и глюкозу,Для лучшего растворения компонентов среду подогревают до 50-б 0 С ипериодически перемешивают круговымидвижениями в колбе или стеклянной палочкой. После полного растворениявсех компонентов прозрачную желтосоломенного цвета среду агариэуют.Высокое содержание углеводов присравнительно низком уровне азота всреде обеспечивает оптимальные условия для образования грибами коевойкислоты,Лимонная кислота обуславливаеткислую реакцию среды (2,5-3,0),необходимую для превращения микромицетами сахара в коевую кислоту,а также служит одновременно консервантом, который обеспечивает ростна данном субстрате грибов-кислотообразователей, в частности видоваспергиллов, для многих штаммов которых лимонная кислота часто является естественным продуктом метаболизма и препятствует при этом развитию на нем других видов гифальныхгрибовдрожжей, бактериальной.флоры и актиномицетов. Поэтомупредлагаемую среду можноиспользовать в работе, соблюдая условия стерильности посева исследуемого материала (а также разлив среды в сте 5 10 15 20 25 ЗО У 35 4 45 50 бО 65 ририльную посуду), не подвергая ее специальной термической стерилизации.ДифФеренциация токсинообраэующих грибов-продуцентов коевой кислоты при помощи разработанной среды основана на использовании характерной качественной реакции ее с хлорным железом. Образуемая при взаимодействии коевой кислоты с 0,1-ным раствором хлорного железа красная окраска крайне чувствительнафи позволяет обнаружить ее в субстрате при разведении 1:2000000 (5-5,5 мкг/мл)Вишнево-красная пигментация среды вблизи колоний грибов, растущих на среде с индикатором, означает присутствие в субстрате коевой кисло-. ты.Для сравнения высеваемости видов аспергиллов и дифференциации среди них продуцентов коевой кислоты на предлагаемой среде и среде-прототипе производят на них посев микробных ассоциаций, содержащий, помимо исследуемых видов рода А,врегцо 11 ць, другие виды грибов, а также актиномицеты.Дифференциацию аспергиллов-продуцентов коевой кислоты производят по вишнево-красной пигментации колоний и субстрата - при высеве ассоциаций михробов на предлагаемую среду,. или общепринятыми методами, включающими выделение чистых культур грибов-продуцентов, культивирование их на жидких средах с последующим колориметрическим определением содержания коевой кислоты в культуральных жидкостях, грибов и проверкой токсичности ее в опытах на лабораторных животных - при высеве ассоциаций микроорганизмов на среду-прототип.я.На среде-прототипе отдельные виды аспергиллов либо вообще не выделяются, либо из-за отсутствия оптимальных условий не выявляют способности продуцировать коевую кислоту.Появление ярко- или темно-красных зон (размер зоны и интенсивность ее окраски зависит от концентрации в субстрате коевой кислоты) может быть отмечено вблизи колоний, едва заметных невооруженным глазом, и почти всегда у колоний диаметром 2-10 см,Это преимущество предлагаемой среды дает возможность быстро произвести дифференциацию токсинообразующих микомицетов по признаку (образуют они или не образуют токсин коевую кислоту уже через 24-48 ч после инокуляции среды исследуемым материалом, а не в течение 7-10 сут, как это требует общепринятый прием анализа неблагополучных кормов при высеве их на общеприменяемые среды).Предлагаемая среда определенного состава элективна для роста аспергиллов, в том числе потенциальных токформула изобретения До 1 л Составитель М,МирзаевТехред М.Рейвес Корректор Г.Назарова Редактор Н.Потапова Заказ 8675/52 Тираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/Бфилиал ППП ."Патентф, г,ужгород, ул.Проектная,4 синообраэователей - А.У)ачо, чтодает возможность испольэовать ее длядифференциации этой группы грибов отсопутствующих микроорганизмов, населяющих корма и другие субстраты, атакже характеризуется свойством 5быстро выявлять среди микомнцетоввиды и штаюаю продуцирующнх микотокссин - коевую кислоту. Среда для быстрой дифференциации токсинообразукщих грибов, включающая рахароэу или глюкозу, натрий азотнокислый, калий фосфорнокнслый одноэамещенный, калий хлористый, магний сернокислый, железо сернокислое эакисное, агар-агар и воду, о т - л и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повьаоения элективности для токсинообразующих грибов, она дополнительно содержит лимонную кислоту и хлорное железо, причем компоненты содержатся в средещем соотношении, г/л:Сахароза илн глюкозаНатрий азотнокислыйКалий фосфорнокислыйоднозамещенныйКалий хлорнстыйМагний сернокислыйжелезо сернокислоеэакисноежелезо хлорноеКислота лимоннаяАгар-агарВода дистиллирован-.ная источники информации,принятые во внимание при экспертизес1. РуководСтво для изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. М., изд.МГУ, 1967.2. Спесйвцева Н.А., Хмелевский В.Н