Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека 1 типа

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИ ЕСПУБЛИ 39/21)5 С 12 М 7/О Е ИЗОБ Т ИС С ВИДЕТЕЛ ЬСТВ ВТОРСК ся к вирусологии, сокоэффективно го ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКАТИПА(57) Изобретение относита именно к разработке вы Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии, в частности к культивированию вирусов, а именно к разработке высокоэффективного способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), пригодного для использования в диагностических тест-системах, в частности иммуноферментной, иммуноблотинге. а также для получения инфекционного вируса, иммунизации лабораторных животных и др,Известен способ получения антигенов 1 АЧ, основанный на культивировании уникальной культуры-продуцента вируса, сконструированной на основе перевиваемых Тлимфоцитов человека с помощью сортера клеток. в результате чего была получена культура, максимально обогащенная клетками, имеющими сайты связывания, специфичные для вирусаАЧ. способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Цель - ускорение способа, увеличение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающего персонала, Клетки штамма ГКВ Мт 4005(перевиваемые моноциты человека, хронически инфицированные ВИЧ) сокультивируют с перевиваемыми лимфоцитами человека линии МТв соотношении 1:(1-9), Через 4-5 сут культивирования клетки осаждают и полученной культуральной жидкостью инфицируют клетки МТ, На 4-е сутки культивирования инфицированные клетки МТосаждают центрифугированием, обрабатывают лизирующим буферным раствором и инактивируют инфекционный вирус. 2 табл. Однако второй этап получения анти- генов вируса остается традиционным - очистка вируса с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароэы.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения антигенов ретро- вируса НТ Чпри культивировании Т-клеточной линии лимфоцитов человека НТ, штамм Н 9/НТ ЧВ, который селектирован по фенотип зрелых Т-лимфоцитов; ОКТЗ (62%); ОКТ 4 (39%); ОКТ 8, и может в течение длительного срока продуцировать вирус НТ Ч(ВИЧ). Фирмы "Оо Роп(", "АЬЬот" (США) и "И/еИсогпе" (Великобритания) используют для тест-систем высокоочищенный антиген ВИЧ, получаемый при культивировании штамма-продуцента Н 9/НТ 1 ЧВ.Однако известный способ требует культивирования инфицированных клеток вбольших обьемах, что резко повышает риск инфицирования работающих и требует создания условий с высоким уровнем защиты. Последующая очистка вируса связана с ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Зто трудоемкая процедура, требующая высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования.Недостатком известного способа является низкая стабильность при культивировании используемого штамма-продуцента, который требует периодического подсева неинфицированных клеток, что приводит к риску вытеснения иэ культуры продуцирующих ВИЧклеток неинфицированными, а также длительность процесса: по данным иммунофлюоресценции нэ 6-е сутки культивирования доля вируспродуцирующих клеток составляет 32 О и только на 14-е сутки достигает 97 оь. При определении активности обратной транскриптазы (за активность обратной транскриптазы принимают включение радиоактивной метки в импульсах н 1 мл культуральной жидкости) для штамма Н 9/НТИ-ШВ даже к 14-м сутам культивиров,ля включение метки не превышает 4,1 х 0 имп/мл.4Целью изобретения является ускорение способа, повышение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающегоо персонала.Поставленная цель достигается использованием обогатительного пассажа на перевиваемых лимфоцитах человека линии МТ, которые обеспе ивэют продуктивный тип инфекции,Сущность предлагаемого способа заключается в следуюгцзм.Клетки штамма-продуцента ВИЧ(штамм ГКВ М 4005) сокультивируют с клетками перевиваемой линии лимфоцитов человека МТв соотношении 1:1 - 1:9 (обогатитель,ый пассаж). Через 4-5 сут культивирования суспензию клеток центрифуги руют и культ; ральной жидкостью инфицируют клетки МТ. После 4 сут культивирования инфицированные клетки МТосаждают центрифугированием, обрабатывают лизирующим буфером и инактивируют инфекционный вирус, Полученный таким образом лизат клеток может быть использован в кэ .естве антигена в диагностических тест-системах, в частности таких, как иммуноферментная и иммуноблотинг.П р и м е р 1. Сокультивирование клеток МТс клетками-продуцентами ВИЧ,В роллеаоную бутыль, содержащую (4,8-5,4) 10 клеток МТприливают (4.8 - 5,4) 10 клеток посевной культуры ГКВ М 4005(т.е. соотношение клеток МТи клеток-продуцентов ВИЧсоставляет 1:1).Примеры использования других соотношений клеток в обогатительном пассаже приводятся в табл, 1. Содержимое роллерной бутыли тщательно перемешивают и разливают по (3,2 - 3,6) 10 клеток в стериль 8ные роллерные бутыли, В каждую бутыль доливают ростовую питательную среду по300 + 10 мл, Питательную среду для культивирования готовят следующим образом, К 415 + 2 О мл питательной среды ЯРМ 1-1640приливают 75 й 10 мл сыворотки плода коровы, 10+ 1 мл 3%-ного раствора й-глутамина, 1,0+ 0,1 мл 30-ного раствора линкомицина (или канамицина 100 мкг/мл), 8,0 + 10 мг гентамицина. Засеянные роллерные бутыли инкубируют при 36 - 37 С и частоте вращения 1 - 2 об/мин в течение 4-5 сут,По окончании инкубации контролирую гуровень вируспродукции иммуноферментным методом. Подготовку образцов для ИЭА осуществляют, инактивируя ВИЧдо бавлением к пробе твинадо конечнойконцентрации 0,1% с последующей инкубэцией при 6 + 2 С не менее 24 ч, Из приготовленных таким образом ыроб готовят ряд последователаФЬ"рфкрэтных разве дений, которые затем вносят попарно по100.ф. 1 мкл в лунки сенсибилизированных планшетов тест-системы "Вектор" или "АЬЬоц", Дальнейшие операции и учет результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению тест-системы. За титр вирусного антигена принимают то конечное разведение исходного материала, в котором достоверно выявлялся антиген ВИЧ(табл. 1),П р и м е р 2. Получение лизата инфицированных ВИЧклеток МТ.Посевной ВИЧдля, заражения клетокМТполучают следующим образом, На 4- 5-е сутки сокультивирования (пример 1) содержимое роллерных бутылей переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 4 2 С, частоте вращения 5000 об/мин (4000 9) в течение 10 мин. Полученный супернатант используют далее в качестве по 50 севного ВИЧ.В роллерную бутыль, содержащую(2;6-2,7) 10 клеток МТ, приливают9520 + 20 мл посевного ВИЧ, содержимое бутыли тщательно перемешивают и инкубируют при 36-37 С не менее 1 ч (адсорбция ВИЧна клетках МТ), По окончании адсорбции суспензию инфицированных клеток рассеивают в роллерные бутыли по 2,0 й 0,1 10 клеток в бутыль. доливают ростовую питательную среду(как в примере 1) до конечного обьема 400 .ф.20 мл. Засеянные роллеры инкубируют на роллерной установке при 36 - 37 С и частоте вращения 1-2 об/мин в течение 96 . 5 ч. 5По окончании культивирования отбирают пробы культуральной жидкости и клеток и определяют в них титр антигена ВИЧметодом иммуноферментного анализа (по примеру 1), а также оценивают долю вирус продуцирующих клеток (ВПК) методом непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) с сывороткой крови, содержащей антитела к ВИЧ. Кроме того, уровень вируспродукции оценивают по активности обратной 15 транскриптазы (табл. 2).За активность обратной транскриптазы принимают включение радиоактивной метки в импульсах на 1 мл культуральной жидкости, Культуру клеток МТ, инфици рованную ВИЧ:1 переносят в центрифужные стаканы и промывают охлажденным до 6:" 2 С физиологическим раствором (рН 7,4). Осадок промытых клеток ресуспендируют в физиологическом растворе до кон центрации (20.2) 10 кл/мл ю добавляют равный обьем лизирующего буфера, охлажден ного до (6 + 2)С.Лизирующий буфер готовят следующим образом. 30Навеску трис (0,12 .ф. 0,01 г) растворяют90 мл физиологического раствора, с помощью соляной кислоты доводят рН до 7.6 + 0,1. К полученному раствору прибавляют 1,0.ф.0,1 мл тритона х, навески 35 0,05-ф 0,01 г азида натрия, 0,01 +0.001 г ингибитора трипсина (фирмы "519 гпа") и 0,02 й 0,001 г фенилметилсульфонилфлуорида той же фирмы. После полного растворения обьем доводят до 100 мл. 40После 10-минутной инкубации при 6 + 2 С лизированные клетки переносят в центрифужные пробирки вместимостью 45 мл, уравновешивают и центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 12000 45 об/мин и температуре 6 + 2 С (центрифуга (-8, "ВесЬпап", ротор )А), Осадок отбрасывают, а к супернатанту приливают этиленимин до конечной концентрации 0,1 - 0,01%, Лизат клеток замораживают, оттаивают, приливают равный обьем буферного раствора А, перемешивают и центрифугируют в роторе ЗАпри частоте вращения 18000 об/мин и температуре 6 + 2 С в течение 15 мин.Буферный раствор А готовят следующим образом. Навеску трис 0,6 + 0,05 г растворяют в 90 мл физиологического раствора. доводя рН до 7,4 + 0,1. К полученному раствору прибавляют навески 0,03 + 0,003 г ЭДТА, 0,1 ф.0.01 г дезоксихолата натрия, 0,1 + 0,01 г додецилсульфата натрия и 1,0 -ф.0,1 мл тритона х. После полного растворения обьем раствора доводят до 100 мл,Предлагаемый способ получения анти- гена ВИЧпозволяет выделять полноценный вирусный антиген, содержащий полный набор вирусспецифических белков. Кроме того, потери вируснь 1 х белков при получении антигена составляют не более 20-30. Формула изобретения Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека типа, включающий культивирование инфицированных клеток на стандартной питательной среде с последующим получением вирусного антигена, о т л и ч а ю щ и й с я тем. что, с целью ускорения способа, повышения выхода антигена и снижения риска инфицирования работающего персонала. из клеток используют лимфоидные клетки МТ, их инфицирование проводят культуральной жидкостью, полученной в результате совместного культивирования клеток МТс перевиваемыми моноцитами человека штамма ГКВ %4005, взятых в соотношении 1:(1-9) в течение 4 - 5 сут, э антиген готовят через 4 сут культивирования лизированием клеток.Таблица 11717631 Таблица 2 Составитель А.ПокровскийРедактор И,Дербак Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец аказ 853 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям113035, Москва, Ж, Рауаская наб., 4/5 ГКНТ СС 1 роизводственно.издательский комбинат "Патент". г, Ужгород, ул,Гагарина, 101