Способ культивирования штамма-продуцента вируса иммунодефицита человека i типа

(71) Все ский инс "Вектор" (72) М.А и О.А.Пл (53) 578 992/30-131.880.90. Бюл. В 37оюэный научно-исследователитут молекулярной биологии(56) Р 1 гудин Л.И, ки сыворотки КРС гии, 980, В 5,Патент США У 4 кл. С 12 М 5/00, (54) СПОСОБ КУЛЬТ ПРОДУЦЕНТА ВИРУСА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА (57) Изобретение б очист- вирусоло и др. Спос- Вопросы640.647773,1987.ИВИРОВАНИЯИММУ 11 ОДЕф ШТАММА1 ЦИТА тноситс иот Изобретен логии и виру пользовано и тических и про препаратов.Целью изо шевление спо осится к биотехни, может быть исизводстве диагнотических вирусных о ол и пр фила етения является удепроПри культивиро дуцента вируса имм ка 1 типа (ВИЧ) ходимого компонен анин штамм чело нодефицитав качествепитательн еобсре о ную 6000 ы используют сыворотку крупн огатого скота (КРС), обработ олиэтиленгликолем мол. массо конечная концентрация 8-97), олнительным многократным зам живаГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР нием - оттаиванием сыворотки 2 нологии и вирусологии и может быть использовано при производстве диагностических и профилактических вирусных препаратов, Целью изобретения является удешевление способа, Способ заключается в том, что для культивирования клеточной линии, продуцирующей ВИЧ, используют питательную среду, содержащую в качестве добавки, стимулирующей рост клеток, сыворотку крупного рогатого скота, обработанную полизтиленгликолем и дополнительно подвергнутую замораживанию - оттаиванию. Способ позволяет получить 15 л культуральной жидкости за 1 пассаж при роллерно-суспензионном куль- а тивировании. Способ может быть испольФ зован для производства диагностических препаратов ВИЧ. 2 табл.С: физико-химические и биохимические показатели сывороток представлены в табл. 1.Данные табл. 1, представленные по результатам не менее пяти экспериментов, показывают, что очищенная сыворотка не содержит у-глобулиновой фракции и по ряду показателей приближена к сыворотке крови плодов коровы.1Влияние питательной среды, содержащей очищенную сыворотку КРС, на вирус- продукцию культуры клеток, хронически инфицированных ВИЧ, представлено в табл. 2 (по результатам 5 серий).Результаты табл. 2 показывают, что использование предлагаемой среды, содержащей очищенную сыворотку крови КРС, не приводит к изменениям пара159738.8 метров культуры клеток по сравнениюсо средой известного способа, содержащей сыворотку крови плодов коровы"Г 1 ою". На протяжении 24 пассажейуровень вируспродукции клеток на питательных средах с очищенной сывороткой КРС остается на том же уровне,щчто и на средах, содержащих контрольную сыворотку. 10Способ культивирования моноцитар)ной линии клеток - продуцентов ВИЧ с использованием предлагаемой питательной среды отработан в лабораторных условиях на роллерной установке 15в роллерно-суспенэионном режиме(объем 30 л).П р и м е р 1. Очистка сыворотки КРС,Кровь КРС собирают в убойном цехе. 20Коагулированную кровь отстаивают при4 С , течение 48 ч для оптимальногоьсбора сыворотки. К 20 л сыворотки,отделенной от сгустка крови, медленно с перемешиванием добавляют 40%-ный 25водный раствор полиэтиленгликоля мол.массой 6000 до конечной концентрации8%, Затем смесь отстаивают при 4 фСв течение 17-20 ч, Супернатант собирают в стеклянные бутыли емкостью0,5 л и замораживают. После замораживания сыворотку оттаивают и вновьподвергают замораживанию. Цикл замораживание - оттаивание повторяют4 раза, сыворотку отфильтровываютчерез ватно-марлевый фильтр, анализируют на фракционный состав (табл. 1)и подвергают стерилизующей фильтрациичерез мембранные фильтры с диаметромйор 0,22 мкм. Очищенную таким образом сыворотку используют для культивирования клеток - продуцентовВИЧ.П р и м е р 2. Очистку сывороткиКРС проводят аналогично примеру 1, 45но к сыворотке добавляют полиэтиленгликоль до конечной концентрации9%, а цикл замораживания - оттаивания повторяют 3 раза.П р и м е р 3. Культивированиеклеток - продуцентов ВИЧ. Во флакон со средой КРМ 1-1640 ,стерильно после добавления антибиотиков (гентамицин 160 мкг/мп и лин комиции в конечной концентрации 0,06%) и глютамина до конечной концентрации 0,03% вводят очищенную сы. воротку КРС в следующем объемном соотношении компонентов, %: среда85 сыворотка 15.Культивирование моноцитарной линии клеток - продуцентов ВИЧпроводят при посевной концентрации 8 хх 10 кл/мл в роллерных пластиковыхбутылях объемом 2 л при соотношениижидкой и газовой фаэ 1:5 соответственно, частоте вращения роллера 12 об/мин и температуре 36,5 Ы,5 ОС.При пересеве клеток - продуцентовВИЧчерез 4-6 сут инкубации половину объема суспензии клеток сливаютдля дальнейшего использования, добавляют такой же объем свежей питательной среды роста и инкубируют в техже условиях.Выход вируссодержащей культуральной жидкости с одной роллерной установки (76 роллерных бутылей) заодин пассаж составляет 15 л. Урожайсобирают на протяжении 24 пассажей.П р и м е р 4. Культивированиеклеток проводят аналогично примеру 3,но используют питательную среду, содержащую 15 об.% сыворотки кровиплодов коровы "Р 1 ои". Результатывируспродукции клеток представленыв табл. 2,П р и м е р 5. Культивированиеклеток - продуцентов ВИЧ Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но используют питательную среду, содержащую 7,5 об.% очищенной сыворотки КРС и 7,5 об,% сыворотки крови плодов коровы "Р 1 оы". Результаты вируспродукции клеток на питательной среде с частичной заменой сыворотки крови коровы по сравнению с известным способом (табл. 2): морфология клеток нормальная; индекс пролиферации 2,10+0,18; доля живых клеток 69,41 .+0,05; доля ВПК по НИФ 4-40,%; титр ИФА 1/(64 й 7), показывают, что использование среды с частичной заменой сыворотки "Р 1 оч" не приводит к изменениям параметров культуры клеток. П р и м е р 6. Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но питательная среда содержит 15 об,% сыворотки КРС. Результаты использо- . вания такой питательной среды отрицательны. Роста клеток - продуцентов ВИЧне наблюдают.51 Формула изобретения Способ культивирования штамма - продуцента вируса иммунодефицита человека 1 типа на стандартной питательной среде с добавлением сыворотки крови, о т л и ч а ю щ и й с я 1 Та блица 1 Показатели Сыворотка Очищенная сыворотка КРСПредлагаемая 15 Известная 15 Нормаль- ная 2,22+0,47 71,7 М,06 1/(91 132)1/(1001.34) 10-30 10-30 2 э 11 фОэ 57, 70 ф 8+Оэ 04 То же П р и м е ч а н и е. ВПК - вируспродуцирующие клетки; НИФ - непрямая иммунофлуоресценция; ИФА - иммунофлуоресцентный анализ. Редактор И.Дербак Заказ 3032 Тираж 486 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж-Э 5, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Прозрачность,ед,опт.плот.Общий белок,г.л -Фракционный состав белков, %альбуминм-глобулинр -глобулину-глобулинОстаточныйгемоглобин,г л-" 5973886тем, что, с целью удешевления способа, иэ сывороток используют сыворотку крупного рогатого скота, которую перед употреблением обрабатывают 8-97-ным полиэтиленгликолем мол. массой 6000 и подвергают 3-4-кратному замораживанию - оттаиванию. Морфоло- ИндексДоля живых Доля ВПК, Титр ИФАгия кле- проли- клеток, Х Х по НИФток ферации Составитель И.ТарееваТехред М.Дидык Корректор Л.Пилипенко