Способ восстановления вирулентности чумного микроба

1717 бЗ РЕСПУБЛИК я)5 С 12 М ЗОБРЕТЕНИ Ис СВИДЕТЕЛЬСТВ К АВТ(56) Елфимова А.И. Изменение свойств возбудителя чумы в условиях эксперимента,/Изменчивость микроорганизмов ибактериофагия, - М., 1960, с. 295-296.(54) СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЧУМНОГО МИКРОБА(57) Изобретение относится к медицинскоймикробиологии, в частности к способам поИзобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам повышения вирулентнасти штаммов чумного микроба,При проведении экспериментальных работ в научно-исследовательских лабораториях противочумных учреждений требуется высоковирулентная субкультура вирулентного штамма чумного микроба, Известно, что при длительном хранении в лабораториях и при пересевах на искусственных питательных средах чумной микроб снижает свою вирулентность. Такие субкультуры не пригодны для работы.Известен способ повышения вирулентности субкультур вирулентных штаммов чумного микроба путем многократного пасГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР вышения вирулентности штаммов чумного микроба. Цель изобретения - ускорение способа. К перитонеальным макрофагам морских свинок добавляют культуру вирулентного штамма чумного микроба в соотношении 1:10, Полученную суспензию культивируют в среде 199, содержащей 10- 20 О, инактивированной сыворотки крови человека, в течение 24 ч при 37 С, после чего макрофаги разрушают дистиллированной водой, а освободившимися из них микробными клетками инфицируют свежую культуру макрофагов. Способ может быть использован для повышения вирулентности субкультур вирулентных штаммов чумного микроба, снизивших ее в процессе хранения, 3 табл. сирования через организм экспериментэль- а ных животных. По известному способу двухсуточную культуру чумного микроба, О выращенную при 28 С на агаре Хоттингера, вводят подкожно экспериментальным животным, которых на 4 - 5-е сутки забивают, делают высевы из регионарного лимфатического узла, печени, селезенки нэ соответствующие питательные среды и полученной а субкультурой вновь заражают животных.Однако по известному способу каждый пассаж занимает 5 - 7 сут. Кроме того, частота получения субкультуры следующего пассажа зависит от индивидуальных особенностей животных.Цель изобретения - ускорение способВеличина ЛД 5 о ЛДзо ЛДзо ИсходнаяПасси ованная 1800 12,5 10506,2 3800 25,0 П р и м е р 1. Перитонеальные макрофаги получают промыванием брюшной полости морских свинок 20 мл среды 199 с гепарином (5 ед/мл), содержащей 10% сыворотки крови человека, инактивированной при 56 С в течение 30 мин. Определяют концентрацию макрофагов путем подсчета в камере Горяева и добавляют взвесь субкультуры вирулентного штамма, выращенного в течение суток при 28 С на агаре Хоттингера (рН 7,2), таким образом, чтобы соотношение количества макрофагов и числа микробов составляло 1:10.Приготовленную взвесь макрофагов с бактериями разливают по 1 мл в стерильные пенициллиновые флаконы (по 3-4 флакона на одну субкультуру), которые закрывают стерильными резиновыми пробками и инкубируют при 37 С в течение 1 ч, Прикрепившийся слой клеток промывают средой 199 для удаления неприкрепившихся клеток и внеклеточно расположенных микробов и заливают 2 мл среды 199, содержащей 20% инактивированной сыворотки крови человека, Среду заменяют свежей через 6 ч культиврования при 37 С и продолжают инкуэировать при этой температуре еще 18 ч, после чего среду культивирования сливают и к оставшемуся на стенке флакона слою макрофагов добавляют 0,2 мл дистиллированной воды, осторожно снимают пипеткой монослой макрофагов и флаконы встряхивают, Макрофаги при этом разрушаются и расположенные внутри них микроорганизмы высвобождаются. Полученной взвесью микробов, собранных из 3 - 4 флаконов (первый пассаж субкультуры), инфицируют свежие макрофаги для получения следующего пассажа. Проведено 3 пассажа.Вирулентность исследуемых штаммов определют по общепринятому методу титрования на животных и выражают величиной ЛД 50, Полученные данные приведены в табл, 1, из. которой видно, что 3-кратное пассирование егзиа резбз 1204 существенно повышает его вирулентность (в 170 раз). П р и м е р 2, Проводят аналогичнопримеру 1, но содержание сыворотки в среде 15. Проведено 2 пассажа, так как ЛД 5 оисходной субкультуры значительно ниже,5 чем в примере 1, Полученные данные представлены в табл, 2.Из табл. 2 видно, что двукратное пассирование предлагаемым способом субкультуры . резтз 773 существенно повышает ее10 вирулентность(в 7 раз),П р и м е р 3. Проводят аналогичнопримеру 1, но содержание сыворотки всреде 20, Проведен 1 пассаж, так какЛД 5 о исходной субкультуры ниже, чем в15 примере 2. Полученные данные представлены в табл. 3,Из табл. 3 видно, что однократного пассирования предлагаемым способом субкультуры . резбз 1300 достаточно, чтобы20 повысить ее вирулентность до максимальной величины.Преимуществами способа являются егоускорение в 5-7 раз по сравнению с общепринятым способом (1 и 5-7 дней соответ 25 ственно) и экономия животных, так какэкссудата от одной морской свинки достаточно для одновременного пассирования 5субкультур, Кроме того,. частота получениясубкультуры следующего пассажа не зави 30 сит от индивидуальных особенностей животного,Формула изобретения 35 Способ восстановления вирулентностичумного микроба, включающий инкубирование культуры в чувствительной биосистеме с последующим выделением микроба, о тл ичающийся тем,что,сцельюускорения 40 способа, в качестве чувствительной биосистемы используют макрофаги морских свинок, заражают их культурой в соотношении 1:10 и инкубируют в течение суток в среде 199, содержащей 10-20 инактивирован ной сыворотки крови человека, а выделяютмикробы путем разрушения монослоя макрофагов дистиллированной водой,Л 5 о -99 в мик обных клетках1717630 Таблица 2 каз 853 Тираж Подписное ВНИИХИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 КНТ СССР Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгор гарина,Составитель Е,ДорошенкоРедактор И.Дербак Техред М,Моргентал Корректор М.Пожо