Способ определения -экзотоксина

(55 6 01 М 33/50, С 1 1/00, А 01 й 63 ОСУДАРСТВЕННО ИЗОБРЕТЕНРИ ГКНТ СССР Й КОМИТЕТМ И ОТКРЫТИЯМ"1","1 я ОПИ ИЗОБРЕТ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ центрифугируют полученныи супернатант, наносят полосой на пластинку силуфола УФ 25), хроматографируют в системе пропанол - аммиак - вода, элюируют /3-экэотоксин с хроматограммы, фильтруют элюат через мембранный фильтр для удаления частиц силуфола, определяют оптическую плотность отфильтрованного элюата при длинах волн 260 и 230 нм, вычисляют концентрации 3-экзотоксина по формуле6 0260 - 0230 ЧоЧ 2Сэт = --- - - , мас, ,ь,5,75 гпоЧ 16,6где Чо - обьем мл, в котором суспендируют навеску препарата; п 1 о - навеска препарата (мг); Ч 1 - обьем раствора, наносимого на хроматограмму; Ч 2 - обьем раствора, используемого для спектрометрирования. В случае исследования культуральной жидкости Чо и п)о = 1 Ч - обьем культуральной жидкости, наносимой на хроматограмму. Отклонение от средней величины не превышает 2 - 3. 5 табл. о-исследовательскиймикробиологииШ,Исангалини льство СССР 33/50, 1987.-Э КЗОТОКится кбьзован 3 -экзо епарат прощен ности р сина. В )В -экзо ть трил иотехнолоо для опретоксина в ах. Целью ие способа еэультатов суспензию токсин, или он Б, затем Изобретение относится к б логии и может быть использо определения количества экзотокс томопатогенных препаратах.Цель изобретения - упрощени и повышение достоверности ре определения экзотоксина. ной хроматогра мотографии элю ранный фильтр с измеряют оптич при длинах волн количество/3-эк эффициента рас иотехноано для ина в энро е мкм, рата яют способа ультатов е 6 02605.7 Чо Ч 2оЧ 16,6-экзотоксина эаас, ,омоп это ген н ыи и ренасыщенном водном Суспензию центринерастворившиеся ин, содержащийся в т методом тонкослойгде Чо - обье навеску препап)о - навес Ч - обьем матограмму, м м, в котоата, мл;а препааствора ром суспендирую ата, мг; наносимого на хр(71) Всесоюзный научинститут прикладной(57) Изобретение относгии и может быть исполделения количестваэнтомопатогенных призобретения является уи повышение достоверопределения ф -экзотокпрепарата, содержащегов культуральную жидкос Способ определен ключается в следующе Используемый эн парат растворяют в растворе трилона Б,фугируют, удаляют вещества, 3 -экзоток супернатанте, очищаюфии, полученныи после ат фильтруют через м размером пор 0,1 - 0,2 ескую плотность филь 260 и 230 нм и опреде зотоксина при значени четным путем по формЧ - объем раствора, используемого для спектрофотометрирования, мл, для определения Ст (мг/мл) в культуральной жидкости в формуле полагают п =Ч, = 1.16,6 - поглощение чистого/3-экзотоксина при концентрации 1 мг/мл;Око, Огузо - поглощение элюата при соответствующих длинах волн.Добавление трилона Б (динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты) крайне важно для препаратов, которые получены на питательных средах, содержащих ион ы двух валентн ых металлов (хлористый кальций, хлористый или серно-кислый магний и др)Экзотоксин обладает способностью образовывать слаборастворимые комплексы с ионами двухвалентных металлов и поэтому при наличии в питательной среде двухвалентных ионов часть 3-экзотоксина связана и не отделяется при выделении традиционными методами, Это приводит к заметно заниженым результатам определения /3-экзотоксина как в препарате, так и в культуральной жидкости, Например, в препаратах, полученных на поликомпонентной среде, содержащей 0,2 СаС 2, 20 - 25% ф-экэотоксина в связанном состоянии, а на ацетатной среде, содержащей 3 - 4 ф, ацетата кальция, связано 60 - 70;6 3-экзотоксина, Добавление избытка трилона Б, который связывает двухвалентные ионы, приводит к освобождению и растворению ф -экзотоксина.В табл,1 показаны результаты исследований на примере чистого (чистота 99,57 ь) /3 -экзотоксина.П р и м е р 1, К 2 мл водного раствора ф -экэотоксина в концентрации 6 мл/мл (0,6;6) добавляют 20 мкл 57 ь-ного водного раствора СаСг. Для ускорения процесса осаждения добавляют несколько капель 25-ного водного раствора аммиака, доводя рН до 8,0 (об осаждении судят по помутнению раствора). К 2 мл суспензии, содержащей нерастворимый комплекс /3 -экзотоксина с кальцием, а также свободный экзотоксин, добавляют 6 мл насыщенного раствора трилона Б или 6 мл дистиллированной воды (контроль) и фильтруют через фильтр "Владипор" М 1 или М 2 (размер пор 0,1 - 0,2 мкм), То же делают при отсутствии хлористого кальция. В фильтратах определяют значение оптической плотности при длине волны 260 нм.Как следует из табл,1, добавление трилона Б не сказывается на поглощении 3-экзотоксина. При добавлении СаСг примерно 336 ф -экэотоксина осаждается, что приво дит к снижению оптической плотности. При добавлении жерилона Б результат практически совпадает с величинами, полученными при растворении чистого 8-экэотоксина в воде.При хроматографии 100 мкл образца наносят "полосой" на пластину силуфола УФжа размером 20 х 20 мл. Количество З-экзотоксина, наносимого на пластинку, должно быть таковым, чтобы после элюации обеспечивать поглощение выше порога чувствительности используемого спектрофотометра,Фильтрование элюата проводят с целью удаления частиц силикагеля, вызывающих светорассеяние образцов, отражающееся на точности определения оптической плотности. Концентрацию ф -экэотоксина в препарате определяют по формуле, где первый сомножитель (в скобках) дает истинное поглощение /3-экэотоксина, вычитая вклад примесей, присутствующих в препаратах: 25 30 35 40 45 50 55 5 10 15 20 6 Ож - Огузо Ч 1Ч 2 5,75 про Ч 16,6= 0,84/60 ж - Огузо, мас. ,где Ч - объем раствора трилона Б. в котором суспендируют навеску препарата, мл,що - навеска препарата. мг;Ч 1 - объем раствора, наносимого на хроматограмму, мл;Ч 2 - обьем спектрофотометрируемого раствора, мл;16,6 - поглощение чистогоф -экзотоксина при концентрации 1 мг/мл при 260 нм.Для определения Сэт, мг/мл, в культу- ральной жидкости во - Ч - 1.Определение точности метода производится по контрольным опытам с применением высокоочищенного ф -экэотоксина (чистота 96 - 987 ь). Затем составляют пробы с заранее известным содержанием ф-экзотоксина (в качестве наполнителя, в частности, используют препарат лепидоцид, не содержащий ф -экэотоксина).Результаты представлены в табл,2.Статистический анализ приведенных зависимостей показал, что точность предлагаемого метода выше, чем + Зф,П р и м е р 2. Исследуемый препарат (0,5 г) суспендируют в 8 мл насыщенного водного раствора трилона Б. Суспенэию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин, Супернатант (100 мкл) микрошприцом наносят полосой на пластину силуфолв Уфю 20 х 20, с края наносят свидетель - чистый 3-экзотоксин. Пластину хроматогра1672365 20 Таблица 1 Таблица 2 фируют в системе пропанол 25 ф - аммиак - вода ( 10:2;5). Положение разделенного вещества определяют в Уф-свете, Адсорбент переносят в бюкс для элюирования с помощью 5 мл 0,01 М раствора аммиака. элюат фильтруют через мембранный фильтр "Владипор" (0,1 - 0,2 мкм) для удаления частиц силуфола и измеряют оптическую плотность при длинах волн 260 и 230 нм, Концентрацию р -зкзотоксина определяют по укаэанной формуле,Результаты представлены в табл.3 и 4.П р и м е р 3, 8 культуральную жидкость (5 мл), содержащую Р -экзотоксин, добавляют 20 мг трилона Б, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 5 мин, 100 мкл супернатанта наносят полосой на пластину (20 х 20) силуфола УФгч. Далее по примеру 2. Концентрацию 3-экзотоксина определяют по формуле приведенной в примере 1, полагая п 1 о = Чо = 1.Результаты представлены в табл.5.Предлагаемый способ прост, имеет чувствительность, позволяющую определять концентрацию 3-экзотоксина во всех промышленных препаратах и в культуральной жидкости на разных стадиях производства препаратов, а также при их хранении. Способ не требует дефицитного оборудования и реактивов, анализ может быть проведен в течение 30 мин, что позволяет его отнести к экспресс-методам. Способ может быть полезен в научно-исследовательских и заводских лаборатОриях как альтернатива длительным биоиспытаниям и используемым полуколичественным методам определенияр -экэотоксина,Формула изобретения Способ определения /3-экзотоксина.предусматривающий удаление нераство римых веществ из исследуемого образца споследующей очисткой /3 -экзотоксина методом гонкослойной хроматографии, измерением оптической плотности полученного элюата и определением количества экзоток сина расчетным путем, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа и повышения достоверности, перед удалением нерастворимых вещесгв в исследуемый образец вносят трилон Б. перед измерени ем оптическои плотности элюат фильтруютна мембранных ультрафильтрах с размером пор 0,1 - 0,2 мкм, а количество Ст экзотоксина рассчитывают по формуле С 6 Огю - Огзо Чо Чг мэс 3 5,75 п)о Н 1 16,625 где Ого и Огзо - поглощение элюа 1 а присоответствующих длинах волн;Чо - объем, в котором суспендируют навеску препарата,мл;ао - навеска препарата,мг;30 Ч 1 - объем раствора, наносимого на хрома 1 ограмму, мл;Чг - объем раствора, используемогодляспектрофотометрирования, мл,для определения Сэ, мгlмл, в культураль ной жидкости в формуле полагают аоЧо =1.1672365 Таблица 3 Таблица 4 аблиц Составитель И.ЗалунинТехред М.Моргентал Корректо едак зори изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 2836 Тираж 394 ВНИИПИ Государственного комитета по изобрет 113035, Москва, Ж, Раушск