Способ стабилизации протеазы bacillus suвтilis

к биотехологииментныхпользова Изобре 1,0 М во еских ки К- (СООМ)С -остат мывают О, 1- лей органич ным раст лот обще ом со- ормулы где К -М щелочно-земель ло и ил ныи металл;- 1 или 2 (на ример, ацетать ция или магния натрия, кал пропионат н трия, валератаминат натрия,рия и др.).т до исчезновех водах. Препарат. хя, глут нат йат н с повторя промывн омыв л ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Чуенко А.В., ДавиденкоПотапский 0 Л. и,цр, Иммобилитеолитических ферментов на песредствах, - Докл. АН УССР,Геол., хим, и биол. науки,с. 81-84.Авторское свидетельствоР 1161552, кл. С 12 И 11/00(54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ПРВАС 11,1 ЛЯ БПВТ 11,1 Б(57) Изобретение относитсянологии, в частности к технполучения нерастворимых феркомплексов, и может быть ис е относится к биотехногии, в частности к технологии полу чения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине и ветеринарии.Цель изобретения - увеличение ста бильности препаратовиммобилизованной протеазы при хранении.Препарат протеазы из Вас 111 цз зцЬ 1 з, иммобилизованной на активированной 2,4,6-трихлор,3,5-сим-триазином (ТТ) целлюлозной матрице, про(51)5 С 12 И 11/00, 9 в микробиологическои промышленности, медицине и ветеринарии. Цель изобретения - увеличение стабильности препаратов иммобилизованной протеазы при хранении. Способ заключается в том, что препарат протеазы из Вас. зцЪТд.з, иммобилиэованцой на активированной 2,4,б-трихлор,3,5 - сим-три - азином целлюлозной матрице, промывают О, 1-1 М водным раствором солей органических кислот общей формулы В-(СООМ), где В - остаток, содержаший от одного до четырех углеродных атомов; М - щелочной или шелочно-земельный металл; и = 1 или 2 (например, ацетаты натрия, кальция или магния, пропионат натрия, валерат натрия, глутаминат натрия, сукпинат натрия и др.). Промывку повторяют до исчезновения белка в промывных водах.оПрепарат хранят при 4-6 С в виде 10- 307-ной суспензии. После хранения в течение 24 мес, сохраняется 45-807 активности. 1 з,п. ф-лы, 2 табл.1597390 ты, обладающих буферной емкостью на поверхности частиц микрокристаллической целлюлозы. После иммобилизации 5протеазы на носителе остается некоторое количество активного хлора, При хранении препарата протекает медленный процесс сольволиза, приводящий к локальному и общему понижению рН среды: целлюлоза целлюлоза Инактивация нейтральной протеаэыв кислой среде протекает с более высокой скоростью, поэтому понижениерН ухудшает стабильность иммобилизованного препарата, Результаты исследования стабильности иммобилизованной протеазы при длительном хранении(табл, 1) показывают, что специфическая сорбция анионов стабилизирующихдобавок является решающим факторомувеличения стабильности, Промывкаиммобилизованных препаратов буфернымирастворами другого состава не оказывает стабилизирующего действия(табл. 1, опыты 11 и 12).Использование катионов щелочныхметаллов в составе стабилизирующихдобавок также оказывает положительное влияние на стабильность иммобилизованной протеазы. Это можно объяснить тем, что растворы солей щелочноземельных металлов повышают протеолитическую активность как нативного,так и иммобилизованного Фермента.Для иммобилизованной формы ферментаэтот эффект значительно более выражен, чем для нативного препарата.Стабилизирующий эффект добавок.понижается с увеличением неполярногоостатка К, поэтому предпочтительнымистабилизирующими добавками являютсяацетаты,При использовании стабилизирующих добавок в кочцентрациях менее0,1 М стабильность препаратов постепенно понижается. Применение добавок в концентрациях, превышающих1 0 М экономически невыгодно, по 955скольку увеличение стабилизирующегоэффекта не наблюдается.Полученные препараты иммобилизованной протеаэы из В, эцЬх 1 хэ обхранят при 4-6 С в виде 10-307.-ной суспензии в 0,1 М ИаС 1. Во время промывки используют стабилизирующие добавки в виде 0,1-1,0 М растворов органических кислот щелочных или щелочно-земельных металлов.Значительное увеличение стабильности иммобилиэованной протеаэы достигают за счет сорбции анионов кислоладают высокой стабильностью при хранении во влажном состоянии. Способность препарата эффективно удалять некротические ткани и гнойную массу с раненой поверхности сохраняется по истечении 2,5 лет хранения. Препарат в виде мелкодисперсной суспензии можйо наносить тонким, однородным слоем, вводить внутриполостно с помощью иглы или катетера. При применении иммобилизованного препарата или лечении гнойно-некротических ран сокращается срок лечения больного на 4-9 дн. Добавки не оказывают заметного влияния на стабильность нативного фермента. Растворы нативного фермента в условиях опыта полностью теряют активность при хранении в течение 1 мес. Более выраженный эффект наблюдается только для солей щелочно-земельных металлов (табл. 1, опыт 13), катионы которых подавляют автолиз металлопротеаз.П р и м е р 1, Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,1 М ацетатомнатрия.- Целлюлоэный порошок (10 г) суспендируют в 100 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,2), охлаждают до 15 С, добавляют 1 г ТТ, растворенного в 50 мл ацетона, и перемешивают 15 мин, Смесь фильтруют и дважды промывают смесью ацетона с водой (1:1). Осадок суспендируют в 50 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8,5) и добавляют 100 мл раствора протосубтилина ГЗх (штамм В. ЯцЬС э). Перемешивают 4 ч при 15 С. Полученный продукт промывают 0,1 М раствором ацетата натрия (порциями до 50"75 мл) до исчезновения белка в промывных водах. Получают 9-9,6 г продукта (в пересчете на сухое вещество). Хранят в виде 20%-ной суспен1597390 Состав промывочногораствора Опыт Протеолитическая активность, %, после хранения,мес,0 1 2 3 6 12 24 Известный0,1 М ацетат натрия(пример 3) 100 58 100 78 125 91 111 80 66 60 71 65 68 61 5зии в 0,1 М МаС 1 при 4-6 С в течение двух лет.П р и м е р 2. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом кальция.Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, промывают 0,5 М раствором ацетата кальция, хранят в виде 20%-ной суспензии в О, 1 М ИаС 1 при 4-6 С в течение двух лет.П р и м е р 3. Стабилизация иммобилиэованной протеазы 1,0 М ацетатом магния. Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, промывают 1,0 М раствором ацетата магния (50 мл) и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М ИаС 1 при 4-6 С в течение,двух лет.П р и м е р 4. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,075 М ацетатом натрия.Препарат иммобилизованной протеаэы получают по примеру 1, промывают 0,075 М раствором ацетата натрия и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М ИаС 1 при 4-6 С в течение двух летП р и м е р 5. Стабилизация иммобилизованной протеазы 1,25 М ацетатом магния,Препарат иммобилизованной протеа- . зы получают по примеру 1, промывают 1,25 М раствором ацетата магния и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М МаС 1 в течение двух лет.Данные по изучению протеолитической активности препарата по примеру 1-5 приведены в табл. 1.П р и м е р 6. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом кальция. Препарат иммобилизованнай протеазы получают по примеру 1, применяяраствор протосубтилина ГЗх из штаммаВ. эпЬ 1 хв. Промывают 0,5 М 5раствором ацетата кальция, хранят ввиде 20%-ной суспензии в 0,1 М ИаС 1опри 4-6 С в течение двух лет.П р и м е р 7. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом натрия.Препарат иммобилиэованной протеазы получают по примеру 1, применяяраствор протосубтилина ГЭх из штаммаВ. эцЪ 1 хэ 1-1. Промывают 0,5 Мраствором ацетата натрия, хранят ввиде 20%-ной суспензии в 0,1 М ИаС 1при 4-6 С в течение двух лет.Данные но изучению протеолитичес кой активности препарата по примерам 6 и 7 приведейы в табл. 2. Формула изобретения 25 1. Способ стабилизации протеазыВас 11 цэ эцЬТд 1 з, иммобилизованнойпосредством активации целлюлознойматрицы 2,4,6-трихлор,3,5-сим-триаэином, обработкой препарата послеиммобилизации раствором соли, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения стабильности препаратапри храненчи, обработку препаратапосле иммобилизации проводят раствором соли органической кислоты общейформулы К-(СООМ),где К - С -С -остаток;М - щелочной или щелочно-земельныйметалл;п = 1 или 2.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что обработку препаратапроводят 0,1-1,0 М раствором соли орга ничес кой кислотыТаблица 1 37 26 12 1 0 85 85 87 81 801597390 Продолжение табл. 1 Состав промывочногораствора Опыт 100, 69 63 43 .37 69 65 68 67 62 64 54 51 53 65 113 8 100 67 .100 85 00 62 100 50 68 62 67 52 64 60 58 60 58 61 56 48 .45 63 48 0 0 3 0 93 51 97 58 20 33 39За 100% принимается активность препарата перед обработкой стабилизирующими добавками.Нативный фермент хранят в 0,1 М ацетата кальция. Та блица 2 Протеолитическая активность, %, после хранения, мес.Пример Состав промывочногораствора 0,5 М ацетат кальция 100 73 ЭО 58 55 57 55 0,5 М ацетат натрия 118 89 73 64 72 69 61 1Составитель А.СеменовТехредМ.Дидык Корректор М.Пожо Редактор И.Дербак Тираж 487 Подписноекомитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Заказ 3032 ВНИИПИ Государственного 113035,Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ухгород, ул. Гагарина, 101 0,075 М ацетат натрия(рН 8,0)13 Нативный фермент0,1 М ацетат кальция Протеолитическая активность, %, после хранения,мес,0 1 2 3 б 12 24 0 1 2 3 6 12 24