Способ получения лейциновой т-рнк

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 12 И 15/ 0 НИЕ ИЗ ТЕНИЯ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ рн нстит нтинова ва, С.Н ондарев робчен - Во3459.я 1,.8 шдяСгу Во 1.7804. СояяЬеш.,У 21,При енолдекстран пенью окислеК 2,4 г д 500000, раст лированной в мас трана периодата натрия, растворенного в 50 мл НО, рН реакционной среды доводят до 3 бикарбонатом натрия, Реакцию ведут 1 сут. От низкомолекулярных примесей избавляются 10-дневным диализом против дистиллированной воды с рН 5,8. Получают 120 мл готового продукта с концентрацией 15 мл ,",льдоенолдекстрана на 1 мл раствора.Данный продукт хранится без измео нений в течение 6 мес. при 4 С, Определяют количество альдогидридных групп, Оно равно 50 на 100 звеньев декстрана, соответственно степень окисления декстрана равна 25. альдоенолдекстра Синтезирструктуры ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) С. Мат 1. ес а1968, т. 7, 9 10, рП.Ч., РагкпшС 1978, . 253 Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот (тРНК).Целью изобретения является упрощение способа и повышение чистоты тРНК.Способ заключается в том, что выделяют тРНК, проводя реакцию аминоацилирования вьделяемой тРНК, связывают аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК, отделяют образовавшийся продукт от несвязанных тРНК, проводят щелочной гидролиз и осуществляют дальнейшее вьделение тРНК, при этом реакцию связывания аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдоенолдекстраном мол. мас.500000 и степенью окисления 25-50 при рН 5,5-6,0, а стадию отделения образовавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлю(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙЦИНОВО тРПК(57) Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот (тРНК)Целью изобретения является упрощениеспособа и повышение чистоты вьделениятРНК, Способ заключается в том. чтореакцию связывания аминогруппь аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдоенолдекстраном, а стадию отделения абразогавшегося продукта от несвязанных тРНКосуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе,р 1, Получение альдомол. мас. 500000 и сте ия 25. воренного в 50 мл дисоды, добавляют 2, 1 гвысоко еа является удобнь яют леициносо 1 х на которым р кционным реагентом для связыванияс аминогруппой аминоацилированной1 ОтРНК,Пример 2. Выделвую тРНК из ЕзсЬегхсйгаДЕАЕ-целлюлозе,Связывают аминогруппы аминолейциновой тРНК с альдоенолдекстраном,Аминоацилирование лейциновой тРНКпроводят с лейцином, меченным по С.1 фК 240 ед. суммарной тРНК, в составекоторой находится аминоацилированнаялейциновая тРНК, растворенной в 1 млдистиллированной воды, добавляют2 мл водного раствора альдоенолдекстрана концентрации 15 мг в 1 мл. Дляудаления РНКаз из реакционной смесидобавляют 4 мг бептонита, Реакциюведут в течение 48 ч (рН дистиллированной воды 5,5-6,0) при 4 С., Стадия выделения декстранаминоацилироваппой тРНК, Для отделениядекстран-лейциновой тРНК от избытка,альдоенолдекстрана и непрореагировавших тРНК реакционную смесь наносятна колонку, заполненную ДЕАЕ-целлюлозой, размером 12 1 см, Элюирование35сначала проводят низкой ионной. силой;50 МКоАс буфером, рН 4,5 и 0,2 МИаС 1 (буфер Р 1). При этом выходитальдоенолдекстран и декстранлейциновая тРНК.40После достижения нулевой плотности (Анм) проводят смену элюирующего буфера: 50 М КоАс, рН 4,5 и1,5 М ИаС 1 (буфер Р 2), Высокой ионной силой вымывается вся непрореагировавшая тРНК. Контроль за вымываниемс колонки продуктов проводят по измерению плотности на А о и радиоактивности по С,По плотности вымывают 12 ед, тРНК5 О(3 ед, плотности - вклад поглощенияальдоенолдекстрана), т.е. 100% индивидуальной лейциновой тРНК, по актив,ности - 85% (следует учесть, что наличие соли при выделении гасит счет),55фракцию (с 10 по 18 мл), содержащую декстранлейциновую тРНК, гидролизуют по сложноэфирной связи при рН8,9 в трисовом буфере в течение 12 чотсутствие других полос указывает на высокую степень очистки индивидуальной тРНК, а также на то, что выделяемая по предлагаемому способ тРНК в процессе очистки не дегради рует.Для проверки чистоты выделенной тРНК проводят исследования взаимод ствия неаминоацилированных тРНК с альдоенолдекстраном. й К 240 ед. неаминоацилированной тРНК, растворенной в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл водного раствора альдоенолдекстрана. Условия проведения реакции, как в примере 2. Далее наносят на ДЕАЕ-целлюлозу и моют буфером Ф 1. С колонки вымывается чистый альдоенолдекстран, не связанный ни с одной.тРНК, что свидетельствует об отсутствии примесей при 20 С. Смесь после гидролиэа наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой. Элюирование отгидролизованной декстранлейциновой аминокислоты проводят буфером Р 1, элюирование деацилирован. ной лейциновой тРНК проводят буфером .У 2. Лейциновую РНК переосаждают из этанола.Проводят проверку биологической активности выделенной лейциновой тРНК с помощью ферментативного аминоацилирования лейциновой аминокислотой удельной радиоактивностью 1-45 рМ. Обогащение 1200 рМ на 1 ед. лейциновой тРНК, что соответствует мировым стандартам. Для аминоацилирования используют суммарную синтетазу и поэтому обогащение получается чуть ниже ожидаемого.Проверка, чистоты выделяемой тРНК. Для подтверждения чистоты выделяемой индивидуальной тРНК проводят электрофорез. Образец тРНК денатурируют в смеси 50% формалина и 6% формальдегида в течение 10 мин при 65 С. Электрофорез проводят на 10%-ном полиакриламидном геле в 0,1 М трисборатном буфере рН 8,3 и 7 М мочевине 4 ч, 200. Окраска метиленовой синькой, На электрофореграмме видно, что одна полоса соответствует лейциновой тРНК,Составитель С;БандринТехред М,Дидык Корректор М.Пожо Редактор С.Пекарь Заказ 3032 Тираж 495 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 159739 других тРНК в выцеленной индивидуальной тРНК, а значит, и ее чистоте.Аналогично выделению лейциновойтРНК проводят выделение любой из 20 аминокислот.5Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чистоту индивидуально выделяемых тРНК, высокий ( 1002) выход. Способ прост в осуществлении, так как не содержит ника,ких уникальных операций и сложного оборудования, используются отече- ственные препараты.Формула изобретения15Способ получения лейциновой тРНК, включающий выделение тРНК, проведе 1 6ние аминоацилирования тРНК, связывание аминогруппы аминокислотногоостатка аминоацилированной тРНК, отделение образовавшегося продукта отнесвязанных тРНК, проведение щелочного гидролиза и дальнейшее выделение тРНК, отличающийсятем, что, с целью упрощения способаи повышения чистоты тРНК, связываниеаминогруппы аминокислотного остаткааминоацилированной тРНК проводятс альдодекстраном мол, мас. 500000и степенью окисления 25-50 при рН5,6-6,0, отделение образовавшегосяпродукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе,