Способ получения тромбина

ПИСАНИЕ ИЭОБРЕТА ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт хской физики АНорганической хопЬгоОСУДАРСТВЕККЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(56) Наггоп М.И,С., Ведоесг 1 Е аГГдпдгу оГ Ьцтпап, гаЬЬдг апй Ъ гЬгошЬ 1 пе Гог верЬаговеуя 1 пе огЬег соп 3 цдаея.В 1 осЬетп. В 1 орЬ АсСа, 976, ч.421, р, 575-585.Уи Х.1., Р 1 всЬег А.М. ег а 1. п 1 гу сЬгошагоргарЬУ оЕ гЬгошЬ 1 п щой 1 Г 1 ей ро 1 уясугепе гея 1 пв.-,1. п)аг, 1986, ч,376, р.429-435, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНА (57) Изобретение относится к пр Изобретение относится к производству ферментных препаратов, а именно к способу получения тромбина, применяемого в биоорганической химии.Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активности це левого продукта.Согласно предлагаемому способу получения тромбина иэ активированной протромбиновой фракции сыворотки крови, включающему центрифугирование и аффинную хроматографию, аффинную хроматографию проводят на аминогексил агароэе, модифицированной карбобензоводству препаратов, а именно к способу получения тромбина, применяемого в биоорганической химии, Цельизобретения - увеличение выхода иактивности целевого продукта. Согласно предлагаемому способу получение тромбина из активированной протромбиновой сыворотки крови проводятметодом аффинной хроматографии нааминогексилагароэе, модифицированной карбобенэоксипроизводными дипептидов Р-фенилаланил-Р-аргииина ипиР-аргинил-Р-фенипаланина, осуществляя адсорбцию белков иэ 0,05 М трисбуфера в присутствии 0,1 М ЮаС 1 прирН 7,9-8,10 промывая колонку 0,5 М .раствором МаС 1 и вымывая адсорбированный тромбин иэ колонки совместными линейными градиентами хлористогнатрия от 0,5 до 1,0 М и изопропилового спирта от 0 до 502 при рН7,9-8,1. 2 табл., 1 ил. ксипроиэводными дипептидов Р-фенилаланил-Р-аргинина или Р-аргинил-Р- -фенилаланина, осуществляя адсорбцию белков из 0,05 М трис-буфера и в присутствии 0,1 М НаС 1 при рН 7,9-8,1, промывая колонку 0,5 М раствором ИаС 1 и вымывая адсорбированный тромбин из колонки совместными линейными градиентами хлористого натрия 0,5 1,0 М и изопропипового спирта 0- 507 при рН 7,9-8.1.Сущность предлагаемого способа заключается в применении в качеств аффинного лиганда карбобенэоксипРоиэводных дипептидов,полученных из 0-фенилаланина и 0- аргинина. На аффинном сорбенте, синтезированном иэ аминогексипагарозы и названных пеп 5 тидов, тромбин адсорбируется существенно сильнее примесей, которые можно вымывать нз колонки до десорбции тромбина. Тромбин вымывается в совместных градиентах хлористого 10 натрия и иэопропилового спирта.П р и м е р 1. Синтез аффинных колонок 20 г аминогексилагарозы (приблизительно 65 мл геля) промьщют на стеклянном фипьтре последовательно водой (400 мл), 0,1 М раствором На СО (200 мл), водой (200 мл), переводят в диметилсульфоксид (ДАССО). Для этого гель промывают последовательно 26-, 50-, 75- и 1003-ными растворами ДМСО по 200 мл . Применяют ДАССО, который выдерживают в течение суток над гранулами КОН и перегоняют под уменьшенным давлением над гранулами КОН, 4 г карбобенэоксипроизводного 25 дипептидов 0-фенилаланил-Э-аргинина или 0-аргинил-фенилаланина растворяют в 60 мл ДМСО. В полученном растворе суспендируют аминогексилагарозу и прибавляют 4 г дициклогексилкарбодиимида. Продолжительность проведения реакции при постоянном перемешивании на качалке при комнатной температуре 15 ч. Полученный сорбент промывают на стеклянном фильтре последо вательно ДМСО, этанолом, 50 -ным этанолом и водой (каждого по 300 мл).П р и м е р 2Соответственно примеру 1 синтезируют аффинные сорбенты со следующими лигандами:карбобензокси-0-фенилаланип-аргинии и карбобензокси-аргинип-фенилаланин, Полученными сорбентами заполняют колонки размерами 1,5)30 см, которые уравновешивают 0905 и и тряс-НС 1 с 0,1 М 45ЯаС 1.Протромбин получают иэ плазмы донорской крови исходным из 111 фракций по Кону. Протромбин активируют добавлением суспензии тромопластина э приссутствии СаС 1 при 37 С в течение 30 мин, рН 7,4. Затем нерастворимую часть отделяют на ультрацентрифуге УАСпри 15000 об/мин в течение 26 мин. Полученный раствор диализуют против 0,05 М и трис-НС 1 с О,1 М БаС 1,55 рН 8,0 и наносят на колонку. После нанесения пробы колонки промывают 0,05 М и трис-НС 1 буфером, содержащим 0,5 М ИаС 1, рН 8,0, Адсорбированный тромбин вымывают из колонок с совместными градиентами хлористого натрия (0,5-1,0 М) и изопропилового спирта (О) на 100 мл 0,05 М трис-НС 1 с 0,5 М НаС 1, рН 8,0 и 100 мл 0,05 М трис-НС 1 с 1,О М НаС 1 в 50 -ном иэопропиловом спирте, рН 8,0, Собирают фракции по 6 мл. АкС тивность тромбина в первоначальном растворе и во фракциях определяют по скорости свертывания 0,1 .-ного раствора фибриногена под действием фермента. В 1 мл раствора фибриногена в 0,001 М трис-НС 1 буфере с О, 15 М ХаС 1, рН 7, 4 добавляют 20 мкл исследуемого раствора тромбина и определяют время свертывания.На чертеже показана калибровочная кривая активности тромбина, которая построена по данным, полученным тромбином с известной активностью.фракции, содержащие тромбин, объединяют и определяют оптическую плотность при 280 нм и ферментативную активность. Полученные реэувьтаты представлены в табл,1(объем наносимой пробы 50 мл). При расчете содержания тромбина в миллиграмма учитывают, что его 1 -ный раствор имеет при 280 нм оптическую плотность 18,7.Из табл. 1 видно, что при проведении аффинной хроматографии при комнатной температуре, происходит некоторое уменьшение выхода по активности и получаемые препараты тромбина менее активны. Однако их активность превьппает активность известных препаратов.П р и м е р 3. Колонку с размерами 1,2 ф 13 см заполняют аффинным сорбентом, синтезированным по примеру 1 и имеющим в качестве пептидного лиганда карбобенэокси-аргинил-фенилаланин, Колонку уравновешивают 0,05 М и трис-НС 1 буфером с 0,1 М ВаС 1. рН растворов уравновешивания, нанесения пробы и вымывания адсорбированных веществ изменяют в пределах 7,2-8.5. Все операции проводят при комнатной температуре. Перед нанесением пробы из раствора удаляют осадок центрифугированием. Порядок нанесения пробы и элюирование не отличаются от приведенного в примере 2. Объем пика тромбина 24 мл. Результа1527261 Таблица 1 Температу- Исходная 1 к тив но с ть тромбинпосле хроматографиМ.1.Н .мг Лиганд н сорбенте Выходпо акра раздео ления, С актив тивности,сть,1. Н. /мг ах сималь Средняя по пику ая КЬг-Р-РЬе-Р-Аг КЬв-Аг-О-РЬ 283 208 283 2 Табл Выхо рН разделения Активность тромбина после хроктивнотографии, М.1.Н. ед. сти,64 78 90 78 72 2000 2650 3250 2650 2250 7,2 7,8 8,0 8,2 ты разделения представлены в табл,2(очистка тромбина на аффинной колонкес карбобензокси-аргинил-аланинагарозой, объем наносимой пробы5 мл, исходная активность 26000,3.Н ед./мл, Ю,эо 9,00)Из приведенных в табл.2 данныхвидно, что предлагаемая аффиннаяколонка позволяет получить высокоактивный препарат тромбина с хорошимвыходом лишь в узком интервале рН.Предлагаемый способ позволяет получать в одну стадию с выходом 9099 Х препарат тромбина с удельнойактивностью до 6000 Н.1.Н ед,/мг.Сорбенты, используемые при предлагаемом способе, обеспечивают достаточно высокий выход ферментаРанее для получения тромбина эти сорбенты не использовались,Предлагаемый способ технологичен,сорбенты можно испольэовать многократно. Их сорбционные свойства восстанавливаются после промывания колонки градиентом иэопропиповогоспирта от 50 до ОХ. формула изобретения Способ получения тромбина иэ активированной протромбиновой фракциисыворотки крови путем аффинной хроматографии, проводя нанесение пробыв 0,05 М трис-НС 1 буфере, содержащем 0,1 М МаС 1, с последующей элю О цией тромбина, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличениявыхода и активности целевого продукта, аффинную хроматографию осуществляют при рН 7,9-8,1 на аминогексип агарозе, модифицированной карбобензоксипроизводными дипептидов 0-фенилаланил-Р-аргинина или, Э-аргинил-Р-фенилаланина, проведением после нанесения пробы отмывки сорбента с од новременным удалением балластных белков 0,05 М трис-НС 1 буфером, содержащем 0,5 М НаС 1, осуществлениемэлюции тромбина тем же буфером с совместными линейными градиентами хпо ристого натрия 0,5-1,0 Х и изопропилового спирта 0-507. 4100 6000 99 3050 5100 88 3300 5000 901527261 Я ь ф Составитель А. КарякРедактор О. Ррковецкая Техред М.Дидик Васильев ррект Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород,агарина, 101 Заказ 7481/34 Тираж 501 Подп ис ноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5