Способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциалистическихРеспублик оц 918831(22) Заявлено 210580 (21) 2928187/30-15 с присоединением заявки Мо,СССР но ленам изобретений н открытий(5 СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯАДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ В КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАНА ном, отмывают избыток непрореагировавшего соединения и измеряют радиоактивность второго образца. Сравнивая радиоактивность первого и второго образцов судят о количестве адренорецепторов в клеточных мембранах 1).К недостаткам известного способа относятся невысокая точность количественного определения, длительност анализа, использование двух различных образцов биологического объекта и нестабильность радиоактивномеченого биогенного амина.Целью изобретения является повышение точности, информативности и интенсификации способа. цель достигается те еченого биогенногоспин-меченый биой формулы Поставленная что в качестве амина использую генный амин общ Х - З 1Изобретение относится к исследованию биологических веществ, в частности к способам количественного определения адренорецепторов в биологических объектах, и может быть использовано в иммунохимии для анализа, например, клеточных мембран.Известен способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах, включающий взаимо-действие исследуемого объекта с меченым биогенным амином, а затем с . немеченым соединением иной химической структуры и сравнение результатов специфического и неспецифического связывания меченого биогенного амина с исследуемым объектом. В качестве меченого биогенного амина используют радиоактивномеченый биогенный амин. Причем сначала один образец биологического объекта в виде гомогенизата подвергают взаимодействию с радиоактивномеченным биогенным амином, затем отмывают избыток не" прореагировавшего соединения и из" меряют радиоактивность образца. После этого второй с.бразец биологического объекта подвергают взаимодействию ;с адреноблокатором, а затем с радио" активным меченым биологическим амиК - биогенный амин, вный из группы: ад лин, норадреналин иэопротеренол;спиновая метка в видестабильного иминоксильного радикала,после взаимодействия исследуемогообъекта со спин-меченым биогеннымамином регистрируют первый спектрэлектронного парамагнитного реэонанса полученного состава, затем тот жесостав подвергают взаимодействию снативным биогенным амином и регистрируют второй спектр электронного пара"магнитного резонанса полученного нового состава, после чего по разностиамплитуд второго и первого спектровсудят о количестве адренорецепторовв исследуемом объекте.ГП р и м е р 1. Количественноеопределение-адренорецепторов.Образец миокарда кролика подвер"гают гомогениэации при -5 С. 1,8 мгспин-меченого норадреналина растворяют в 0,5 мл трис-НС 1 буфере,рН 7,05, К этому раствору прибавляют 5 мг гомогениэата и инкубируютпри 37 С .10 мин. Затем полученное соединение промывают трижды по 5 мл охлажденным трис-НС буфером (рН 7,05)и промытый состав переносят в стек- "3 Олянную ампулу, мпулу помещают в резонатор спектрометра электронногопарамагнитного резонанса и регистрируют первый спектр, амплитуда которого характеризует количество неспеци" 35Фически связанного с сопутствующимибелкаМи исследуемого объекта спинмеченого норадреналина. После этого,используя колибровочный график эа:зисимости амплитуды спектра от концентрации спин-меченого норадреналина рассчитывают количество неспеци"Фически связанного спин-меченого норадреналина.Затем к гомогенизату, находящему"ся в ампуле, прибавляют 5 мкл трисНС 3 буферного раствора, рН 7,05, содержащего 0,5 мг нативного битартрата) норадреналина и повторно инкубируют при 37 С в течение 10 мин.При этом молекулы нативного (немеченого) норадреналина вытесняют в раствор молекулы спин-меченого норадреналина, поскольку обладает большимсродством к адренорецепторам. Далеереистрируют второй спектр электронного парамагнитного резонанса и поколибровочному графику определяютколичественное значение суммы специФически и неспецифически связанногонорадреналинй. Сравнивая первое и 6 Овторое измерение определяют количество специфически связанного адренорецепторами спин-меченого норадренали.на. Это значение соответствует3,4 ф 0,3 мкм/мг гомогениэата и харак териэирует количество биологически активных адреиорецепторов.П р и м е р 2. Количественное определение -адренорецепторов.Образец миокарда кролика подвергают гомогенизации при -5 фС. 1,5 мг спин-меченого иэопротеренола растворяют в,0,5 мг трис"НС буФере, рН 7,05.К этому раствору прибавляют 5 мг гомогениэата и йнкубируют при 37 фС 10 минут, Затем гомогенизат промывают трижды по 5 мл охлажденным трис- НСВ буфером (рН 7,05) и переносят в стеклянную ампулу. Ампулу помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и регистрируют первый спектр. Затем к гомогенизату, находящемуся в ампуле, прибавляют 5 мкл трис-НС 1 буферного раствора, рН 7,05, содержащего .0,3 мг нативного гидрохлорида изопротерено" ла и повторно инкубируют при 37 С в течение 10 мин. Ампулу снова помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и снимают второй спектр. По калибровочному графику, исходя иэ амплитуды второго спектра, определяют количественное значение суммы специфически и неспецифически связанного спин-меченого иэопротеренола. По амплитуде первого спектра, используя калибровочный график, определяют ко" личество неспецифически связанного спин-меченого изопротеренола. Затем по разнице между вторым и первым измерениями рассчитывают количество специфически связанного 9 -адренорецепторами спин-меченого изопротеренола.Полученные результаты сведены втаблицу Среднее количество специфически связанного спин-меченого изопротеренола равно 2,83 мкг/мг, Эта величина характеризует количество 5-адренорецепторов в образце миокарда кролика.Выбор того или иного биогенного амина и спин-меченого биогенного амина для использования зависит от типа определяемых адренорецепторов и диктуется способностью взаимодействия с ними. Этой же причиной определяется количество исходных компонентов, участвующих в реакциях, которое для каждого конкретного случая использования способа может быть различным и выбирается различным путем.Предлагаемый способ обладает повышенной точностью определения, поскольку используеМЫе спин-меченые биогенные амины являются стабильными химическими соединениями, в которых метка .присоединена ковалентно, что918831 Количество специФически связанного спин-меченого иэопротеренола, мкг/мг 2,8 2,9 2,8 2,8 2,7 2,8 2,9 2,9 2,8 2,9 формула изобретения 35Заказ 2128/26 Тираж 883 Подписное ВЧИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, 1 Лосква,Ж, Раушская наб., д; 4/5филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 позволяет провести точное определение с помощью спектрометрии электрон"ного параиагнитного резонанса, Этимже Фактором обусловлена и повышенная информати: ность о состоянии клеточных мембран биологического объекта,5поскольку чем точнее определено ко" Номер образца 1 2 3 Способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах, включающий взаимодействие исследуемого объекта с меченым биогеннжл амином, а затем с немеченым соединением ийой химической структуры и сравнение результатов специфического и неспецифического связывания меченого биогенного амина с исследу" емым объектом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности, информативности и интенсификации способа, в качестве меченого биогенного амина используют спин-.меченый биогенный. амин общей Формулы личество адренорецепторов, тем больше информации можно получить о состоянии симпато-адреналовой системыорганизма. Кроме того, время анализа сокращается с 2 ч до 30 мин, атакже способ позволяет снизить расход биологического материала. 4 5 6 7 8 9 10-Я Ж - ъ О- спиновая метка в виде стабильного иминоксильного радикала, после взаимодействия исследуемого объекта со спин-меченым биогенным амином регистрируют первый спектр электронного парамагнитного резонанса полученного состава, затем тот жесостав подвергают взаимодействию с нативным биогенным амином и регистрируют второй спектр электронного парамагнитиого резонанса полученного нового состава, после чего по разности амплитуд второго н первого спектров судят о количестве адренорецепторов в исследуемом объекте. Источники информации,принятые во внимание при экспертизее 1. ВгаЫ ВеэеагсЬ, 1978, 159,р. 125-135.