Способ получения гибридных штаммов дрожжей sасенаgомyсеs cerevisiae для сбраживания крахмала

(51 ИЗОБРЕТЕНИЯЕТЕЛЬСТВУ ОП Л 11 -"Ъ:сО4 г Н ВТОРСНОМ 2 ам- ген хлебоп тения - получение х экспрессирующийс Изобретение отно ной, спиртовой и вленности, в част Цель изобр мов, содержащи глюкоамилазы.Способ закл чают штаммы д гечяхае, сод глюкоамилазы итс пивовареннои ости касается ехл ючается в том, что ожжей Басспагошусе ржащие структурный неактивный аллель с ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР .(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) С.В. Беневоленский, М.А, Нейстат, И.В, Губакина, Л,Ф. Мелешина, Е.В. Рогожкина, СВ. Машко и О.Н, Куренная(56) Технохимический контроль хлебо- пекарного производства, Регламент. Министерство хлебопродуктов СССР, НПО хлебопекарной промышленности, 1975,Авторское свидетельство СССР 707964, кл. С 12 М 1/18, 1977(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ ШТАММОВ ДРОВНЕЙ БАССНАКОЮСЕБ СЕКЕЧ 181 АЕ ДЛЯ СБРАЖИВАНИХ КРАХМАЛА(57) Изобретение относится к хлебо- пекарной, спиртовой и пивоваренной промышленности, в частности к техноло 1 ическим процессам, связанным с ути лизацией крахмалсодержащего сырья, Целью изобретения является получение штаммов, содержащих экспрессирующийнологического процесса, связанногоутилизацией крахмалсодержащего сырс использованием пищевых дрожжейБассЬагошусея сегеч 1 яае. 2 И 1/8, 15/00 //Е Ч:Н 69 ся ген глюкоамилазы. Способ получениягибридных штаммов дрожжей сбраживаниякрахмалсодержащего сырья заключаетсяв создании гибридов дрожжей Басе 11 агошусея сегечхяае, которые содержатгены, кодирующие глюкоамилазу, и способны секретировать этот фермент вкультуральную жидкость. С помощьюспособа достигается интенсивное сбраживание крахмалсодержащего сырья безпредварительного осахаривания коммерческими амилолитическими ферментами или солодом. Гибриды получают путем скрещивания штамма БасеЬагошусеяЙхаясагхспя СВБ 1782, несущего структурный ген глюкоамилазы, и штаммаБасеЬагошусея сегечхяае, несущегоген-репрессор глюкоамилазы. Затем гибриды переносят на питательную среду,содержащую ацетат натрия, для индукции спорообразования, после чего изолируют споры, способные утилизироватькрахмал, и скрещивают их со штаммомБасеЬагошусея сегечяхае, несущиммаркер ауксотрофности, Далее операцииповторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-95%. 1 табл.ответствующего репрессора и способныеиспользовать крахмал в качестве единственного источника углерода, секретируя глюкоамилазу в среду, с одновременным сбраживанием образующейсяглюкозы. Предлагаемые штаммы дрожжейБассЬагошусев сегеном.вае полученыв результате нескольких этапов скрещивания дрожжей Ыассйагошусев Ыассахсия СВЫ 1782, секретирующих глюкоамилазу, с дрожжами ЫассЬагошусевсегечвхае из Петергофских генетических линий, ведущих двое происхожцение и от расы Ы. сегечвае Х 11, атакже с дрожжами - сахаромицнтами изКарбондайльских генетических линий.Предлагаемые штаммы дрожжей Б. се.гечхяхае имеют следующие морфологические и культуральные признаки. 20Клетки имеют овальную, реже почтикруглую форму, средний размер 6,7 хх. 5,0 мкм, Размножение почкованием.Через 96 ч инкубации на сусло-агареобразуют круглые колонии, диаметром4,0 - 6,3 мм. Край колонии ровный илислегка исчерченный, поверхность матовая. Дрожжи сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарову, мальтозу, галактозу,рафинозу, крахмал," не сбраживаютксилозу и арабинозу, Желатину не разжижают, глицерин и спирт (этанол)усваивают. Не усваивают маннит, дульцНт и сорбит,Культуры из полученных генетических линий выращивают в жидкой средена качалке или на агаризованных средах, содержащих один из следуюших источников углерода: глюкозу (2%), мальтозу (2%), сахарову (2%) или этанол(1,5%), а также пептон (1%) и дрожжевой экстракт (или дрожжевой автолнзат) (0,5%) в качестве источника ростовых веществ. Выращенную биомассуиспользуют для посева в среду для 45брожения. Посевной титр составляет(0,5-5,0) 10 кл./мп. Среда для брожения имеет рН 5,0-6,0 и содержитклейстеризованный крахмал (1,5-4,0%)или муку (4%), В случае использования50крахмала в состав среды вводят ростовые Факторы - дрожжевой экстракт(0,5%) или дрожжевой автолизат (0,5%).Брожение проводят при 28 - 35 С в течение 48-96 ч,.Процесс сбраживанияконтролируют по интенсивному выделе 55пию СО.Способ поясняется конкретными при"Мерами. П р и м е р,1. Получение линийдрожжей Б. сегечяае осуществляютв два этапа,Этап 1, Генетические линии Б. сеге 1 яхае получают следующим образом.Культуру клеток Ы, сегеч 1 в 1 ае СВБ1782, секретирующую глюкоамилазу иимеющую генотип БТА 2 ва 10 (ЫТА 2аллель, кодируюций глюкоамилазу, вСа 10 - неактивный аллель ген-репрессораглюкоамилазы), выращивают на полноценной среде с глюкозой в течение48 ч. Далее с помощью микроманипулятора выделяют отдельные клетки, которые раскладывают на полноценнойагаризованной среде, помещая к нимвегетативные клетки штамма Б. сегечваеФ 117 генотипа. вша 2 БТА 10(я 1 а 2 - отсутствие структурных генов глюкоамилазы, БТА 10 - ген-репрессор глюкоамилазы). Через 4 ч инкубации отбирают образовавшиеся зиготыи после этапа вегетативного размножения этих гибридов индуцируют у нихспорообразование на ацетатной среде.Гибриды имеют низкие эффективностьспорообразования и выживаемость спор.Выжившие сегреганты среди споровыхпотомков, изолированных при тетрадноманализе, проверяют на способность ксинтезу глюкоамилазы, что проявляетсяв виде зоны разложения крахмала вокруг колоний, растущих на чашках с питательной средой, содержащей крахмал(1:6%) и имеющей рН 5,4.Этап 2. Отобранные ауксотрофныесегреганты имеют генотип БТА 2 яСа10 айе 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм Б.сегечхя 1 ае Р 134, который несет ауксотрофную мутацию в гене Сеп 2. Приэтом среди потомков каждый раз отбирают синтезирующие глюкоамилазу культуры генотипа БТА 2 яа 10. В третьемпоколении были получены культуры, содержащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу всреде. Такие культуры хорошо скрещиваются как между собой, так и с типовыми линиями Ы. сегечхвхае, давая гибриды с эффективностью спорообразования 93% и частотой выживаемости спор84%, В результате подтверждается, чтосозданы генетические линии дрожжейБ. сегечхвае указанного генотипа,способные секретировать глюкоамилазуи утилизировать крахмал как единствен.ный источник углерода.ют клетки и к 9 частям культуральнойжидкости добавляют 1 ч раствора амилазы в диметилсульфоксиде (50 мг/мл) вкачестве субстратаВ приготовленнойтаким образом реакционной смеси измеряют динамику накопления глюкозы спомощью глюкозооксидазопероксидазногореагента, Исходя из этой динамики рассчитывают активность глюкоамилазы встандартных единицах (мкмоль глюкозы//мп мин). Для разных культур полученной генетической линии активность составляет 0,03 - 0,05 ед, Контрольныйштамм Б. сегечзае Х 11 активностьюне обладает,П р и м е р 5. Использование культур из полученных линий.Набор культур 5-4 А, 5-4 В и 8-11 С,относящихся к созданным генетическим линиям, а также контрольный штаммБ, сегечхзае Х 11, используемый длясбраживания крахмала, выращивают втечение 48 ч на плотной питательнойсреде, содержащей глюкозу (2 ь), дрожжевой экстракт (0,5 ) и пелтон (1 ).По истечении указанного срока клеткизасевают в колбы с жидкой средой, содержащей крахмал (З ) и дрожжевойэкстракт (0,5 ) и имеющей рН 5,4. Посевной титр составляет 110 кл./мл.Засеянные колбы инкубируют при 30 Сбез аэрации для индукции брожения.В таблице представлены результатыизмерения титра клеток и характеристика брожения (ио выделению СО) вди намик е.Из данных таблицы видно, что гибридные штаммы Б. сегечдзхае способныосуществлять процесс брожения, о чемговорит интенсивно возрастающее вовремени выделение СО, накапливатьбиомассу, используя крахмал, подвергающийся одновременному осахариваниюглюкоамилазой, синтезируемой клетками. В то же время штамм Б. сегечыаеХ 11, используемый в способе-прототипе, такой способностью не обладает,Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить новые гибридные штаммы дрожжей Б. сегечзае, способные производить сбраживание крахмалсодержащего сырья без предварительного осахаривания амилолитическими ферментами, Это позволяет сократить расход осахаривающих ферментных коммерческих препаратов или солода, а также исключить технологичес 5 152176 7 6П р и м е р 2. Этап 1. Получениелиний осуществляют по примеру 1.Этап 2. Отобранные ауксотрофныесегреганты имеют генотип БТА 2 вга 105аде 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм Б. сегеч 3.зхае М 1640, который несет ауксотрофную мутацию в гене г гр 1. При этомсреди потомков каждый раз отбирают:синтезирующие глюкоамилазу культурыгенотипа БТА 2 зга 10. В третьем поколении были получены культуры, содержащие структурный ген глюкоамилазы исекретирующие глюкоамилазу в средуТакие культуры хорошо скрещиваютсякак между собой, так и с типовымилиниями Б, сегечвдае, давая гибридыс эффективностью спорообразования 95 и частотой выживаемости спор 90 . В 20результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей Б. сегечхвхае указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный 25источник углерода,П р и м е р 3. Этап 1. Получениелиний осуществляют по примеру 1.Этап 2. Отобранные ауксотрофныесегреганты имеют генотип БТА 2 за 10 30аде 5. Далее с ними проводят последовательные бэккроссы на штамм Б.Сегечхвхае 3 193, который несет ауксотрофную мутацию в гене цга 3, При этомсреди потомков каждый раз отбираютсинтезирующие глюкоамилазу культурыгенотипа БТА 2 за 10. В третьем поколении были получены культуры, со,держащие структурный ген глюкоамилазы и секретирующие глюкоамилазу в сре ду. Такие культуры хорошо скрещиваются как между собой, так и с.тиновымилиниями Б. сегечзхае, давая гибридыс эффективностью спорообразования 90 и частотой выживаемости спор бб ., В 45результате подтверждается, что созданы генетические линии дрожжей Б. сегеч 1 в 1 ае указанного генотипа, способные секретировать глюкоамилазу и утилизировать крахмал как единственный 50источник углерода,П р и м е р 4, Определение активности глюкоамилазы.У полученных культур Б. сегечзхаеопределяют активность глюкоамилазы,Для этого клетки засевают в жидкуюполноценную среду, содержащую растворимый крахмал (3/) и имеющую. рН 5,4.Через 72 ч инкубации при 30 С осажда15217 Ь 7 кий этап предварительного осахаривания,Формула изобр етенияСпособ получения гибридных штаммов дрожжей БассЬаговусез сегечахае для сбраживания крахмала, нредусматривающий скрещивание штамма БассЬаговусез Йавгаьсив СВБ 1782, несущего структурный ген глюкоамилазы, и штамма БассЬагоиусез сегезае, несущего ген-репрессор глюкоамилазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с 1 1 О Культура Рост и брожение культур дрожжей на среде с крахмалом через ч 60 72 Титр кле- Выделениеток С 0 Титр клеток Выделение Титр клеток Выделение 007 Со,1 10 2 10 1 10 9 10 1 10 8 10 5 10 6 10 5 10 4 1 5 10 Составитель В, ГолимбетТехред Л.Олийнык Корректор В. Кабаций- М Редактор Н. Киштулинец Заказ 6892/24 Тираж 501 ПодписноеВЫПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 5-4 Л5-4 В8-11 СБ. сегеттз. - аае Х 11(без предварительного осахаривания крахмала) целью повышения штаммов, содержащихэксирессирующийся ген глюкоамилазыполученный в результате скрещивания,гибрид переносят на питательную среду, содержащую ацетат натрия, дляиндукции спорообразования, после чегоизолируют споры, способные утилизировать крахмал, и скрещивают их соштаммом БассЬаговусев сеген.вае,несущим маркер ауксотрофности, далееоперации повторяют в заданном порядке до получения гибридов с эффективностью спорообразования 90-953.