Способ получения глюкоамилазы

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(51) М. Кл. С 12 З 13/10 ГвввдврвтввввиЯ ввввтвтСвввтв Мввватров СССРво ааааа вввбрвтвивйв втврытвв(45) Дата опубликования описания 170378 М.Е,Бекер, М.А.Дреймане, А.Ф.Апсите,У.Э.Виестур, В.Т.Лука, В.К,Вайваре,Л.И,Орещенко, К,А.Калунянц, В.Д.Беляеви И,К.Черемухин(72) Авторы изобретения Институт микробиологии имени Августа Кирхенштейна АН Латвийской ССР(54) С 11 ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения амилолитических ферментов.Известен способ получения глюкоамилазы глубинным культивированием его продуцентов из рода дрожжей Епдонтт сор ьь 1Ьц 6 Де в аэробных условияхПри этом выращивание продуцента и т 0 главную ферментацию ведут на питательной среде одного состава, содержащей крахмал в чистом виде или вещества, содержащие крахмал 11. Посевной материал, выращенный на данной 5 среде, подают непосредственно в главные ферментаторы, например, передавливанием. Выход 80-120 ед./100 мл. Однако данный процесс длителен, 20 общий цикл составляет 64-68 ч, из которых 48 ч приходится на выращивание продуцента. Приготовление крахмалсодержащей среды затруднено, так как крахмал оседает, затруднена также стерилизация, поскольку крахмал термически неустойчив.Цель изобретения заключается в увеличении активности фермента и ускорении процесса получения глюкоамилазы. ) ЗО Для этого в предложенном способе при выращивании посевий культуры Енто и 1 у сор ы з и выращивании биомассы в качестве источника углерода используют спирт алифатического ряда в количестве 1,5-5,0. Выращивание биомассы следует осуществлять на питательной среде при скорости ее протока, равной 0,3-1,1 ч Предложенный способ заключается в следующем.Посевной материал и биомассу культуры Еидотуеоры а Юсиа.е Ывыращивают на полусинтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода спирт алифатического ряда, минеральные соли, кукурузный экстракт и кашалотовый жир. После выращивания посевного материала его вводят в главный фермЕнтатор, в котором при скорости протока среды 0,3-1,1 ч выращивают биомассу продуцентаЗатем в культуральную жидкость вводят индуктор биосинтеза глюкоамилазы - крахмал, и культивирование продолжают до накопления максимальной глюкоамилазной активности. Полученную; культуральную жидкость сушат или из фильтрата культуральной жидкости вы6П р и м е р 1. В качестве проду цента используют дрожжи Еддощусорьз 6 ЬВ 01 е В.Посевной материал выращивают в течение 18 ч в колбах на качалке при 30 С. Выращенный посевной материалов количестве 10 вводят в Ферментатор, затем в течение 1 ч периодически размножают культуру и после этого переходят на выращивание продуцента 15 непрерывным методом пи скорости протока среды 0,3-1,1 ч , рН 7,0, температуре 30 С и непрерывной аэрацииопри расходе 80 мг/О/л мин.Состав среды для выращивания по севной культуры и выращивания биомассы следующий, :Этиловый спирт 1 5Сульфат аммония 0,25Однозамещенный 28фосфат калия 0,2Хлористый кальций 0,04Кукурузный экстракт 1,0Кашалотовый жир 0,5Культуральную жидкость, вытекающую из непрерывно действующего ферментатора, вводят в периодически действующий ферментатор, в котором в течение 1-2 ч продолжают периодическое культивирование с целью полного усвоения этилового спирта культурой. Затем в культуральную жидкость вводят индуктор биосинтеза глюкоамилазы - крахмал с таким расчетом, чтобы общее количество крахмала в культуральной жидкости составляло 0,5-0,8.После 40 добавления крахмала культивированиеопродолжают при 30 С и непрерывной аэрации до достижения максимальной глюко- амилазной активности. Через 8 ч глюкоамилазная активность в культураль ной жидкости составляет 100 ед./мл по глюкозооксидазному методу.Весь цикл составляет 30-40 ч.П р и м е р 2. Выращивание продуцента и получение посевного материала 50 аналогично примеру 1. После достижения стационарного режима непрерывного выращивания биомассы при скорости протока среды 0,6-1,0 культуральную жидкость вводят в периодически действую щий ферментатор.После заполнения 20-50 полезного объема ферментатора методом притока в течение 6-10 ч приливают пятикратно концентрированную питательную среду, содержащую 20-30 этилового спирта. 6 Интенсивность аэрации повышают пропорционально росту биомассы при условии Р 02 ъ 10 насыщения.После окончания приливания более концентрированной питательной среды Формула изобретения 1. Способ получения глюкоамилазыпутем выращивания посевной культурыиз рода Е 11 сто щу сорэ з на питательной среде, выращивания биомассы 65 и синтеза Фермента на нитательной сре-,деляют глюкоамилазу общепринятым методом.Выход глюкоамилазы составляет 80- 100 ед ./мл . Длительность процесса 30- 40 ч. концентрация биомассы увеличиваетсядважды до 35-40 г/л. После полногоизрасходования этилового спирта культурой в питательной, среде приливаютв водном растворе разбавленныйкрахмал с расчетом, чтобы количество крахмала в культуральной жидкости составляло 0,5-0,8. Затем культивированиепродолжают в течение 8-14 ч при условиях, аналогичных в примере 1. Глюкоамилазная активность составляет 8090 ед./мл. Продолжительность цикла44-52 ч. П р и м е р 3. Посевной материал выращивают в течение 18 ч в колбахона качалке при 30 С. Выращенный посевной материал вводят в количестве 8- 10 в ферментатор, который заранее заполняют питательной средой с этиловым спиртом до 2/3 рабочего объема. Затем культивирование по периодическому проточному методу продолжают при условиях, аналогичных в примере 2.П р и м е р 4. Выращивание продуцента и посевного материала ведут аналогично примерам 1 и 2. Состав питательной среды для выращивания посевного материала и биомассы следующий,:Метиловый спирт 2,0Сульфат аммония 0,25Однозамещенныйфосфат калия 0,2Хлористый кальций 004Кукурузный экстракт 1,0Кашалотовый жир 0,5Количество получаемой биомассы составляет 40 г/л. 11 роцесс главной Ферментации можно вести по примеру 1, 2, 3. Через 10-16 ч глюкоамилазная активность составляет 80 ед./мл. Общий цикл 44-56 ч.Во всех случаях обработку культу- ральной жидкости ведут любым из известных методбв.Таким образом, предлагаемый способ позволил сократить общий цикл на 30- 40 , ускорить приготовление питательной среды для выращивания продуцента, т.к. спирты не оседают и термически более устойчивы, чем крахмал, а также на 30 сократить расход кислорода при аэрации.Предлагаемый способ позволит впервые в Советском Союзе промышленно получить глюкоамилазу микробиологическим путем. В настоящее время ведутся подготовительные работы для внедрения способа на ливанском опытном биохимическом заводе. Предлагаемый объем выпуска 20 усл.т. в год.Заказ 1768/23 Тираж 568 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва ЖРа ская наб. д. 4 5.де, содержащей крахмал, отделения био-массы от культуральной жидкости и выделения фермента из нее, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюувеличения активности фермента и ускорения процесса, при выращивании посевной культуры и выращивании биомассы в качестве источника углеродаиспользуют спирт алифатического рядав количестве 1,5-5. 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что выращивание биомассы на питательной среде осуществляют при скоростифее протока, равной 0,3-1,1 ч Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе:йвторское свидетельство СССРР 340690, кл. С 12 Р 13/10, 1970.