Способ культивирования ткани кукурузы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.СОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19) И 7 2 М 5/00 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СНИДЕТЕЛЬСТ Н АВТОРСК,23 (088.8)РЬ 1111 ра К. Р 1 апСГгош ггззце сц 11 цгеСгор.Бсепсе. 1975,7 - 421. ю средудят допол в тои жев которую лусообразоцетилбутан /л (ДАБ из- денные но ькалиспользования как стимуля вания. осущес усообра Спосо ляется следующим о азом. Посл промыв стерилизации иычлененные незрют в течение 1среде МС с ДАБ. ые зародыш чатков инкуби в жидкои пита.Затем тщальн ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Инстит ний АН УССР (72) Т.Н.Че и В,В.Моргу (53) 578.08 (56) Сгееп гедепега 1 о оЕ шалве. 15,9 5, р.4 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивйрованиютканей растений 1 п чуго, а имеено кспособам индукции каллусообраэованияу злаков, являющейся этапом при регенерации растений путем побеговогоморфогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре ткани злаков и позволяющей получать измененные генотипывследствие спонтанной сомаклональнойи индуцированной мутационной изменчивости клеток,Цель изобретения - повышение индукции каллусообразования и регенерацяонной способности,Способ состоит в том, что передперенесением зародышей на модифици(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТКАНИ КУКУРУЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей растений 1 п чего. Целью изобретения является повышение индукции каллусообразования и регенерационной способности. Способ состоит в том; что перед перенесением зародышей на модифицированную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга производится дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразова 1 ия вводят 1,4- , диазоцетилбутан в количестве 1- 10 мг/л. 2 табл. рованную твердую питательн Мурасиге-Скуга (МС) произв нительное инкубирование их жидкой питательной среде, в качестве стимулятора кал вания вводят 1,4-бисдиазоа (ДАБ) в количестве 1 - 10 мг вестен как мутаген). Прове исследования показали возмпромежуточной реакции между собствен"но каллусообразованием и прорастанием: одновременного формированиякаллуса и недоразвитого побега. Недоразвитый побег отделяют, а оставшийся каллус можно культивировать дальше. П р и м е р 4. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 2, однако количество ДАБ составляет 100 мг/л. Ведущей реакцией является промежуточная реакция, собственно каллусообразование составляет 2,85%, что на порядок меньше, чем в примерах.2 и 3. П р и м е р 5. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 1, но возраст незрелых эародьпйей скороспелой линии ВС 2923 составляет 17 дней после опыления. Каллусообраэование отсутствует, наблюдается лишь прорастание зародьппей.П р и м е р 6. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 2, возраст зародьппей 17 дней (табл.2). Содержание ДАБ в жидкой питательной среде 1 мг/л. При этом наблюдается появление каллусообразования, промежуточной реакции, корнеобразования. 30 21,72 + 3,12 = 24,84%,П р и и е р 7. Условия проведения опыта аналогичны описанным впримере 6, однако количество ДАБ сос"тавляет 10 мг/л, Общая величина кал"лусообразования 13,62 + 6,25 =.21,87%.П р и м е р 8. Условия проведенияопыта аналогичны описанным в примере6, однако количество ДАБ составляет100 мг/л. Общая величина каллусообразования 3,12 + 15,62 = 18,84%. Ведущей реакцией зародьппей является промежуточная, собственно каллусообразо-,вание составило 3,12 %, что значительно меньше, чем в примерах 6 и 7.П р и м е р 9. Условия проведенияопыта соответствуют описанным в примере 1, но возраст незрелых зародышейскороспелой линии ВС 2923 составляет18 дней после опыления. Каллусообразование отсутствует, наблюдается лишьпрорастание эародьппей.П р и и е р 10. Условия проведенияопыта аналогичны описанным в прииере2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАБ в жидкой питательной среде1 мг/л. При этом наблюдается появление 3 150779ельно трижды отмывают жидкой пита ельной средой. Для хранения вычлененных зародьппей, обработки зародьппей/АБ и отмывки от него используют жид 5кую питательную среду, но без 2,4 ихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 Д),минокислот и агара. Обработка расторами ДАБ проводится в чашках Петрири комнатной температуре. Культиируют по два зародыша в пробирках10 мл среды при 27 + 1 С и 16-чаовом фотопериоде. В качестве стимуятора каллусообраэования используютБ в количестве 1-100 игал среды,аточный раствор ДАБ стерилизуютропусканием через бактерицидный фиьтр. Твердая питательная среда дляндукции каллуса содержит 0,25 мг/л,4 Д. 20П р и м е р 1, Незрелые початкиинии ВС 2923, взятые на критический16-й день после цветения, поверхостно стерилизуют лабораторным детер.ентом, трижды промывают стерильной 25одой. Вычленяют из зерновок незрелыезародыши, удаляют эндосперм. ДалееНезрелые зародьппи переносят на тверю культуральную среду и размещаюттком вверх. Каллус инициируют исохраняют на модифицирОванной средеС, содержащей неорганические компо- . Общая величина каллусообраэованияненты по Мурасиге и Скугу, витаминыи аминокислоты по Штраусу, 20 г/лсахарозы, 8 г/л агара. Индукция каллу сообразования достигается при использовании в качестве стимулятора ростагербицида 2,4 Д в концентрации0,25 мг/л. Через 28 дней культивирования проводят учет,. Данные представ-щлены в табл.1. Каллусообразованиеотсутствует, наблюдается лишь прорастание зародьппей,П р и м е р 2. Условия проведенияопыта аналогичны описанным в примере 1, однако перед посадкой зародьппейдля культивирования на твердую питательную среду, помещают их на 1 ч вжидкую питательную среду, содержащую1 мг/л ДАБ. Затем трижды отмываютжидкой питательной средой без ДАБ.При этом наблюдается каллусообразование 24,13%, корнеобразование и прорастание зародышей,П Р и м е Р 3. Условия проведения 55опыта аналогичны описанныи в примере2, однако количество ДАБ составляет10 мг/л. При этом наблюдается увеличение общего каллусообразования1507792 Формула изобретения25 каллусообраэования промежуточнойреакции, корнеобразования. Общая вели-,чина каллусообразования 18,75 + 6,25253.П р и м е р 11. Условия проведенияопыта аналогичны описанным в примере2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАБ 10 мг/л. Общая величина каллусообразования 15,б 2 + 12,50 = 28,12%0П р. и м е р 12. Условия проведенияопыта аналогичны описанным в примере2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАБ 100 мг/л. Общая величинакаллусообразования 3,12 + 9,37 =12,49 7. Ведущей реакцией зароды"шей является промежуточная, собственно каллусообразование 3,12 7, чтозначительно меньше, чем в примерах10 и 11. 20Таким образом обработка незрелыхзародышей скороспелой линии ВС 2923ДАБ в количестве 1; 10 и 100 мг/лрасширяет спектр ростовых реакцийнезрелых зародышей критического дляданной линии 16-дневного и старшеговозраста и обеспечивает возможностьполучения каллуса еще в течение 2-3дней. Кроме наблюдаемых в контролепрорастания и прекращения развитиязародышей в вариантах с обработкойДАБ отмечены каллусообразование,промежуточная реакция (формированиеодновременно каллуса и недоразвитогопобега), интенсивное корнеобразование.Каллус индуцируется двух типов: рых 35лый, светло-желтый с участками позеленения, из которого в дальнейшемвозможна регенерация растений, т.е.тотипотентный и плотный компактныйбелый. Образование тотипотентногоморфогенного каллуса чаще наблюдается. при содержании ДАБ 1 - 10 мг/л,При содержании ДАБ 100 мг/л преобладает образование неморфогенного белого плотного каллуса, полученного в основном от зародышей для которых характерна промежуточная реакция между собственно каллусообразованием и прорастанием.Таким образом, предлагаемый способ индукции каллусообразования из незрелых зародышей кукурузы, включающий обработку зародышей перед культивированием мутагеном ДАБ в количестве 1-10 мг/л более эффективен по сравнению с известным, так как позволяет увеличить в два раза временной промежуток для введения в культуру незрелых зародышей кукурузы, обеспечивает при этом изменение спектра ростовых реакций зародышей определенного возраста и получение тотипотентного каллуса, что воэволяет повысит эффективность селекционной работы на клеточном уровнеСпособ культивирования ткани кукурузы, включающий вычленение зародышей из простерилизованного початка, перенесение их на модифицированную твердую питательную среду МурасигеСкуга, содержащую в качестве стимулятора каллусообразования 2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту и1дальнейшее их культивирование, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения индукции каллусообразования и регенерационной способности, перед нанесением зародышей на твердую питательную среду производят дополнительное инкубирование их в той же жидкой модифицированной питательной среде Иурасиге-Скуга, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-диазоцетилбутан в количестве 1 - 10 мг/л.1507792 Таблица 1 2,4 Д,мг/л Ростовые реакции незрелых зародышей кукурузы после обработки ДАВ Ростовая реакция зародышейк ХКаллус Каллус + Прорастаниенедоразвитыйпобег ДАВмг/л Возрастзародышейдень Примерк т Корне- Развиобразо- тня ванне нет 0,25 16 46,87 24,13 16 10,34 025 13,79,2571 10 0,25 31,03 2,85, .25,710,25 21,72 15,62 3,12 12,50 1 О 025 17 6,25 625 46,87 8 9 100 0,25 3,12 15,62 17 56,25 37,50 0,25 18 6,25 0,25 18 18,75 15,02 3,12 Э 751 1 О 0,2518 1 О 12,50 6,2512,50 Э 751 40,36 28;12 34,66 12100 0,25 18 3,12 9,37 Таблица 2 Влияние возраста незрелых зародьппей линии ВС 2923 на индукцию каллусообразования Данные об изолированных эародьппах Каллусообраэование, а Длина, мм Количество 2,4 Д (мг/л)Возраст, дни 2,0 0,25э а40,6 14 936 50,00 46,15 9,09 15 16 10, 71 18 Составитель ВДемкинРедактор Л.Пчолинская т и.и к,р,и-,Заказ 5516/29 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 1,0 - 1,21,0 - 1,5 1,5 - 2,0 2,0 - 2,5 2,5 - 3,0 24,13 20, 68 285 15,62 31,81 32,14 53,12 41,37 34,48 59,38 31,25 25,00 25,00 6250 3437 38,12 18,18 11,53