Способ определения количества реакционных центров фотосистемы-2 растений

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А И 9) И 01 С 700 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИДЕТЕЛЬСТВ ВТОРСКОМ ен отовердиевалов(54) СПОСОБ РЕАКЦИО Н Н ЫХ РАСТЕНИИ (57) Иэобре логии фотос быть исполь ОПРЕЛЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВ ЦЕНТРОВ ФОТОСИСТЕМЫение относится к физи нтеза растений и може овано в исследованиях у,содержаер (рН 7,8),и инкубиатуре в при в течереакий, и мледовабам определеционных цент жет бьггь исп я коли в (РЦ) ьзован о-функ астев ис ниях структур ганизации пиг циональнои ор ентного аппаС) . пособ примен осис темыИзвестныи м толь препараторастений тов ФСэначитель х зши ниц и требуеремени. ых затратзобретения вляется ловы шен очност способа, достижеки сти и сокращениего универсаль ремени анализ 1. Для определени -2 сугпенэию клет еГЦ ичест УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМГКНТ СССР 1(71) Институт почвоведенисинтеза АН СССР(56) Ргос. МаТ 1. Асас 1, Бс1980, ч,77, Мф 8, р.4712-4 Изобретение относится к биохимии, биофизике и физиологии фото - синтеза растений, а именно к спосопластов и субхлоропластн обогащенных ФС, выс субхлоропластных препа пигментного аппарата фотосистемы растений. Цель изобрет я - повышение точности способа, достижениеего универсальности и сокращениевремени аналиэа. Для этого в анаэробных условиях проводят спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощенияобразцов, приготовленных из целыхклеток низких растений, или образцов хлоропластов и субхлоропластныхпрепаратов высших растений, причемв качестве показателя количествареакционных центров фотосистемы используют количества феофитинапромежуточного акцептора фотосистемы. 3 табл . водоросли помещают в средщую 15-20 мм трис-НС 1 буф35-40 мМ МаС 1, 2 мМ МеС 1руют при комнатной темперсутствии 0,12 тритона Х ние 2-3 мин для нарушения целостно" сти клеточной мембраны. Затем в аликвоте определяют концентрацию хлорофилла (ХЛ) в 80",-ном ацетоне для вычисления величины фотосинтетчиской единицы (ХЛ/Р 11) .Спектрофотометрические измерения фотоиндуцированных изменений поглощения образца проводят в аназробных условиях. Для этого 2 мл полученной реакционной смеси помещают в кювету (1 = 1 см). Лля создания анаэробных условий гуда же вносят избыток 10 мМ 1 Ъ)(+)-п.юкоэы и 50 ед/мл глюкозооксилазы (Б(ища) из расчета, что 1 ед глюкозооксилаэы окисляет1 мкМ -П(+) -глюкозы с одновременным поглощением 22,4 мкл О/мин. Для разложения образовавшейся Н 0 на НО и О одноВременно ВнОсят 1000 ед/мл каталазы иэ расчета, что 1 ед каталазы разлагает 1 мкМ Н 0 в 1 мин. Образовавшийся Овновь поглощается глюкооксидазой. Через 30 - 40 с после окончания реакции созда- О ния анаэробных условий проводят спектрофотометрические измерения фотоиндукцированных изменений поглощения образца (ЬА) при 685 нм, связанных с фотовосстановлением феофитина. Из менения ЬА феофитина при 684 нм проводят на двухлучевой фосфороскопической установке. Мощность зондирующего света 50 эрг см с , мощностьз действующего света 2,8 10 эрг см х 20 х с -. Точность измерения составляет 10ед. оптической плотности, Концентрацию феофитина вычисляют по формуле Бугера-Ламберта-Бера (ЭЕС 1.), коэффициент экстинкции для феофитина при 685 нм составляет 0,32-10 М смПолученные результаты представлены в табл.1.30П р и м е р 2. Хлоропласты выделяют из 1 О-дневных проростков гороха на холоду при (О+4) С. Дляо этого 50 г листьев разрушают в гомогенизаторе (МРИ) в течение 2 - 35 3 с в среде, содержащей 0,35 М МаС 1, 0,02 М трис-НС 1 буфер (РН 7,8) и 2 мг/мп аскорбата натрия. Фильтрат, полученный после отжимания массы через полотно в восемь слоев маРли, 40 центрифугируют в течение 1 мин при 1000 об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант (обломки хлоропластов) от брасывают, а осадок целых хлоропластов ресуспендируют в среде, содержащей 15 мМ трис-НС 1 буфер (РН 7,8) 35 мМ КаС 1, 2 мМ МС 1 . КОнцентрацию хлорофилла определяют в 803-ном ацетоне, Определение количества РЦ ФСв хлоропластах проводят как в примере 1.Полученные результаты представлены в табл.2.П р и м е р 3. Ввщеление фрагментов хлоропластов, обогащенных ФС, проводят по известной методике.Хлоропласты тщательно суспендируют в среде, содержащей 0,07 М фосфатный буфер (РН 7,0), 0,5 М сахарозу и 0,035 М НаС 1. Затем вносят в реакционную смесь 17-ный раствор дигито нина для разрушения хлоропластной мембраны. Затем полученную суспензию обрабатывают на ультразвуковом диспергаторе УЗДН (22 кГц, 400 Вт, 1 мин), чтобы получить фрагменты хлоропластов с одинаковой степенью нарушенности мембран и после добавления НаС 1 (до 2 Х) инкубируют на ледяной бане при энергичном перемешивании в течение 40 мин. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 4000 хя, садок отбрасывают, а к супернатанту быстро добавляют тритон Хдо конечной концентрации 0,1-0, 157 и вновь центрифугируют при 20000 хя в течение 45 мин. Фрагменты хлоропластов собирают и ресуспендируют в среде, содержащей 15 мМ трис-НС 1 буфер (рН 7,8), 35 мМ МаС 1 и 2 мМ М 8 С 1 . Измерения проводят,как в примере 1.Полученные результаты представлены в табл.3.Из табл.1-3 видно, что, используя предлагаемый способ, можно определять количество РЦ ФСи в цельм клетках, и в хлоропластах, и в субхлоропластных препаратах, т,е. предлагаемый способ является универсальным.Использование предлагаемого способа определения количества РЦ ФС"2 растений по сравнению с известным способом обеспечивает повышение точности анализа до 94-98 Х (по известному способу 77-783), сокращение времени анализа до 24 мин (по известному способу 164 мин)достижение универсальности (анализ можно проводить на целых клетках низших растений, хлоропластах и субхлоропластных препаратах высших растений), как следствие сокращения времени анализа достигается сохранение более высокоактивного физиологического состояния образца.Формула изобретенияСпособ определения количества реакционных центров фотосистемырастений, включающий вьщелеиие хлоропластов, ресуспендирование их в буфере, определение концентрации хлорофилла с последующим спектрофотометрическим измерением фотоинду.ср".не фотоинГ Шроа)ныу иео -ни) по);оечия образца ц, овод гпредварительно созданных анлэробныху,човиях, а количество р.акциофныхцентров определяют по феофитину,5с 14948 обтем,споцированных изменений поглощ ниярезца) о т л и ч а ю щ и й с ячто, с целью повьпиеия точностисоба, достижения его универсальнсти и сокращения времени анализа о 5изТаблицаКонцентрацияфеофиФото- Отклосин- нение тети- каядочес- го поОтклонения какдого по- лученного значения от КвадвадрйттклонеИсходная концентрация Хл Опыт эме- нения рат ия,/Х-А/(конкая лученного центрация РЦ),Мх 0 едисреднего, Х-А Х,735 ница, значе- ХЛ/РЦ ния от среднего/Х-А/ХЦелевые клетки1, 13 0,9 2,813109 09 28131,11 0,9 2)813101 08 251,11 0,9 2,8131,08 0,9 2,8 13097 08 251, 13 0,9 2,813 Таблица 2 Отк ння Кэадраотклокения/Х-А/ Опыг Исходная концентрация ХЛКвадрат тклоение фот син эме- ения Концентрацияфеофикаждого попоглотклол 10 нения /Х-А/(ЬА г ческая единица, ХЛ/РЦ центра ция РЦ Ил 0 а при685 нмл 10 ф 1 Хлоропл ас т 3,468 0Заказ 4139/ Тираж 621 ПодписноеВНИЮП Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 1 10,0 2 10, 1 3 10,2 4 10,5 5 10,7 6 10,0 7 10,1 8 10,0 поглощения(кон- центрация РЦ),Мх 10Отклонения каждого по- лученного значения от препараты 0,0488 101 0,2840 100 0,0488 103 0,2840 104 0,2840 106 0,0488 101 0,0488 102 0,0488 101