Способ получения внеклеточной инвертазы из дрожжей

Изобретение относится к биотехноло. гии и может быть использована в микробиологической промышленности, в кондитерской промышленности для приготовления некристаллизуемых начинок, в производстве безалкогольных напитков и как биохимический препарат,Пель изобретения - повышение выхода целевого продукта.Способ заключается в том, что дрожжи культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота, до начала логарифмической фазы роста, проводят обработки в баллистицеском дезинтеграторе в рециркуляционном режиме. продолжают культивирование до конца логарифмической фазы роста, повторяют дезинтеграцию и культивируют дрожжи до максимального накопления иноертазы в среде,Обработка культуральной жидкости в баллистическом дезинтеграторе в рецирку. ляционном режиме не приводит к нарушению (или временной остановке) процесса культивирования, В момент дезинтеграции происходит разрушение части клеток не более 15-20 мас которые через 2-3 ч культивирования не обнаруживаются, Содеркимое разрушенных клеток выходит в среду, за счет чего, вероятно, может интенсифицироваться как рост культуры, так и синтез ферментов, в том числе и инвертазы, Остальные клетки в популяции сохраняют свою жизнеспособность, чем и обьясняется отсутствие нарушения роста культуры, Однако, как показывает электронная микроскопия, клеточная стенка этих клеток видоизменяется, что, по-видимому, и обуславливает нарушение связи инвертазы с клеткой и выход основной ее массы в среду в процессе дальнейшего культивирования.Если в момент дезинтеграции разрушается более 20 клеток процесс проходит также с выходом инвертазы в среду. но увеличивается ега длительность, Обработка культуральной жидкости о баллистицеском дезинтеграторе может быть проведена и в другие моменты логарифмической Фазы роста культуры, но осуществление ее предлагаемым способом (о начале и в конце логарифмической фазы роста) обеспечивает наилучшие результаты как по выходу инвертазы, так и па длительности процесса, Проведение дезинтеграции во время стационарной фазы нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему увеличению содержания инвертазы в среде (см, чертеж).П р и м е р 1. Дрожжи БассМговусезсегеч 1 з 1 ае Твыращивают в 10-литровомферментере (АК) с 5 л среды, содержащей, г/гк пептон 20, сахароза (техн.)30. В качестве инокулята используют 2-суточную культуру, выращенную о колбах на той же среде. Режим ферментации: 80%, насыщения 02; 800 об/мин, рН 5 8.В процессе ферментации о начале логарифмической фазы роста дрожжей проводят обработку всего содержимого ферментера в баллистическом дезинтеграторе ФУГв течение 2 мин. Дезинтеграцию (обработку) "0 проводят в импульсно-рециркуляцианномрежиме в течение 2 мин. скорость вращения ротора 1500 об/мин, абразивный материал - дивинилбензолстирол (микрашарики диаметром 200 - 300 мкм) в количестве 100 мл 15 насыпного объема. Получающийся при этомнативный дезинтеграт с процентом разрушенных клеток не более 15-20 мас, от общей биомассы подают в ферментер, Через 2-3 ч роста в ферментере не обнаружи вают разрушенных клеток.Накопление секретируемой инвертазыпосле обработки с помощью баллистического дезинтегратора ФУГрезко уоелицивается в среде роста (см.чертеж).25 В конце логарифмической фазы роставышеописанную процедуру повторяют.Процесс культивирования продолжают до наступления стационарной фазы роста (40 ц), Максимальная активность иноертазы в 30 среде к этому моменту составляет 26,5Е/мл, удельная активность 13,2 Е/мг белка.Контроль, Осуществляот, как описано впримере, но культивирование проводят по известному способу, т,е. беэ обработки" 35 культуральной жидкости в процессе культивирования в баллистическом дезинтеграторе о рециркуляционном режиме.Ыаксимальная активность иноертазы о среде составляет 4,6 Е/мл. Большая цасть ин вертазы остается связанной с клеткой (37,4Е/мл), для ее извлечения необходимо разрушение клеток, при этом удельная активность в получаемом дезинтеграте составляет 2,05 Е/мг белка.45 П р и м е р 2. Способ осуществляют, какописано в примере 1. но в качестве штаммапродуцента используют дрожжи ЯассЬагащусез сегеч 1 з 1 ае О(303-67 АТСС 26524), Процесс культивирования прадол жают до наступления стационарной фазыроста (30 ч), Максимальная активность иноертаэы в среде к этому моменту 3,6 Е/мл, удельная активность 4,7 Е/мг белка,П р и м е р 3. Способ осуществляют, как 55 описано о примере 1, но в качестве штаммапродуцентра используют Яасс 1 ягагпусез теггез г 1 з 0-28, который выращивают в 100- литровом Ферментере с 70 л среды, содержащей. г/л: пептон 20, сахароза(техн.) 20, В качестве инакулята используют суточную1471559 Ф л э и з о б р е т е н и я 30 инвертазы, отличающийся тем, что, с Формула изоцелью повышения выхода целевого проСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧ- дукта, в процессе культивирования в начэ- НОЙ ИНВЕРТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ, вклю . ле и в конце логарифмической фазы роста чающий культивирование продуцирующего культуральную жидкость обрабатывают в микроорганизма на питательной среде со баллистическом деэинтеграторе в рециркудержащей источники углерода, азота и во- ляционном режиме до достижения степени ду, до максимального накопления: разрушения клеток не более 15 - 20 мэс.%. культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации; 80-90 насыщения 02; 800 об/мин; рН 5,6. Максимальная активность инвертазы в момент выхода культуры в стэционэрнуо фазу роста (37 ч) составляет 9,2 Е/мл; удельная активность 9,8 Е/мг белка,П р и м е р 4. Способ осуществляют, как описано в примере 1, но в качестве продуцента используют ЯассЬагоеусезз сагзЬег 9 епзз 48-16 ССУ, которые выращивают в 100-литровом ферментере с 70 л среды, содержащей. г/л: пептон 20, сахароза (техн.) 20, В качестве инокулята используют 2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80- 85% насыщения 02: 780 об/мин; рН 5,7. Максимальная активность инвертаэы в момент выхода в стационарную фазу роста (42 ч) составляет 16,8 Е/мл; удельная активность 18,2 Е/мг белка.Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход фермента в среду, сократить продолжительность процесса культивирования с 72 до 40 ч, т,е. в 1,8 раза.Препарат инвертазы, полученный предлагаемым способом (удельная активность 13,2 Е/мг белка). содержит значительноменьше посторонних белков и примесейдругих веществ в отличие от препаратов,получаемых выделением ннвертэзы непос 5 редственно из клеток после их разрушения(2,05 Е/мг белка), что дает основание упростить процесс очистки фермента.Так кэк в предлагаемом способе используют хлебопекарные дрожжи, а инвертаза10 накапливается в среде и для ее выделенияне требуется разрушать биомассу, то возникают предпосылки для рассмотрения вопроса об использовании биомассы,остающейся после отделения жидкой фазы,15 содержащей внеклеточные ферменты, дляпищевых целей или для вьделения ценныхвнутриклеточных компонентов,(56) Патент США 20 М 3887434, кл, С 12 О 13/10, 1975. ТзопзеМо А,В.,оразЬп Ч.Ч., КШаеч)еаза о 1 Басс Ьагогпусез цеп о з,и.: мегпатопа зупзрооп оГ ехтгасеЬэг 25 ещувез оГ гпсгоогдапзпзз. Весйпе сазте. СкесЬ, АЬзтгастз, 1986. р,41-42.- сжеибкоте итптчквй илФбюв коипртнюн дариаю 4,- авщИегт 8 юеаммюгю шЮФеюЮ ииеен дауаавле,- дйРеце Вимюирама . оставитель И,Прив ехред М.Моргентал ва Корректор Редактор Л.Волкова отыль аказ 3335 Тираж Подписное НПО Поиск" Роспатента13035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101