Способ получения пептидов и белков в бесклеточной системе трансляции

.С.Спи егзоп В.М 8, р. 2330 нятьо оступным. 2 ил. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТСССРПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ВТОРСНОМЪф СВИДЕТЕЛЬСТ(7 1) Институт белка АН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ТРАНСЛЯЦИИ(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, аименно к использованию бесклеточныхсистем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов и белков п чТго. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет увеличения срока работысистемы трансляции. Способы получения полипептидов в бесклеточных системах трансляции обладают рядом преимуществ как по сравнению с химическими методами (отсутствие необходимости защиты активных групп, высокаяоптическая чистота продукта, относительно низкая стоимость и др.), таки по сравнению с вариантами, в которых используются генно-инженерные методы (предотвращение возможности деградации целевого продукта, отсутствие ограничений в отношении природысинтезируемого полипептида и др.),Основным недостатком всех известныхспособов синтеза полипептидов с использованием клеточного аппарататрансляции является их низкая эффективность. Предложенная совокупностьметодических приемов (нейрерное удаление из сферы реакции синтезированного продукта, непрерывное восстановление расходуемых в реакции ниэкомолекулярных веществ и введение системырегенерации АТР и СТР) обеспечиваетфункционирование аппарата трансляциив длительном режиме и общее повышение эффективности процесса в несколько десятков раэ. Благодаря этому новый способ синтеза полипептидов вбесклеточной системе может примеся для препаративных целей, Особважным представляется использованиеизобретения для получения полипептидов длиной 15-50 аминокислотных остатков, т.кпроизводство их химическим путем является дорогостоящим,а синтез при помощи методов геннойинженерии - во многих случаях мало 1441787Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к использованию бесклеточных сцс 1 тем трансляции для синтеза биологически активных полипептидов з.п чз.Сго.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счетувеличения срока работы системы трансляции. 1 ОВ настоящее время разработан цельзйряд бесклеточных систем трансляциина основе клеточных экстрактов изразличных прокариотическцх и эукариотцческих оргднцэмов. Все эти системы 15характеризуются. низкой эффективностью процесса и обычно обеспечиваютсинтез лишь нескольких,молекул полипептцдд на рибосому, Основные причины столь низкой эффективности бескле точных систем трансляции состоят вследующем;1) бесклеточные системы трансляциисодержат ограниченное количество суб. -гстратов реакции, в первую очередь источников энергии (АТР .ц СТР) Повышение содержания этих компонентозз всистемах имеет определенные цре,целы,прц превышении которых цдбпьзддетсяцнгибированце системы трднспяццц, ЗО2) продукты распада субстратов реакции, в первую очередь АзР, ЛМР,СЭР фосфатьз и пирофосфаты, являютсяингцбиторами системы трансляции,3) сами продукты синтеза (попцпеп тцды) также могут быть ццгцбитордмцотдельных стадий бесклеточной системы трансляции.В настоящем изобретении указанныепричины устраняются зд счет цеирерыв-щного отвода из реакционной смеси продуктов реакции и непрерывного восстановления исходной концентрациинизкомолекулярных веществ, расходующихся в процессе трансляции, 45Основная реакция (синтез ) полипептцда протекает в блоке 1 (фцг,1). Врезультате ее расходуются свободныеаминокислоты, АТР и СТР ц образуютсяпопипецтид, ЛИР, СОР и неорганический 5(1фосфат. Для предотвращения остднопкнпроцесса из бпока 1 происходит одновременно отбор СЭР, ЛМР ц Р 1, ц подача6 ТР, АТР ц аминокислот цз блока 2.Отбор сцнтезцруемого попипептцдд про,исходит (в блоке 3) через мембранув резервуар, из которого буферныйраствор с попипептцдом поступает в колонку с дффцнным цммуносорбентом. На колонке происходит вдсорбция полипептида пд иммунном сорбецте, специфцчном к целевому попипептиду. Дляболее экономичной работы системы в блоке 4 происходит превращение образовавшихся АИР и СОР в ЛТР и СТР, Гуферный раствор из блока 3 после ддсорбццц полипептида также проходит через систему регенерации АТР и СТР и через полупроницаемузо мембрану . вновь поступает в реакционную смесь.11 р и м е р 1. Синтез белка обопочки вируса мозаики костра (ВМ 7) наматрице ВМЧ РНК 4 в эукариотическойсистеме трансляции из зародьшзей пшеницы в стандартной системе и в установке непрерывного действия.Раствор (А) состоял цэ 20 мИ НЕРЕВ, рН 7,6; 2,1 мИ 11 я(оАс), 115 мИ КоАс, 1 мМ ЛТР, 25 мкИ СТР, 250 мкИ спермцдцнд мкМ Г". Н 3 пейццна с удельной радиоактивностью 24 Ки/ммоль ц 25 мкМ каждой из остальных 19,аминокислот, 3 мп Инкубационной смеси, прцготовлепноц нд растворе (Л), содерждпц 80 пцкомопей 808 рцбосом, 20 пцкомопей ВМ 7 РНК 4, 37 оп.ед. А,д бепкоззой фракции 8100, 150. ед, активности цнгцбитора рцбоцуклеаз из ппдценты человека, 0,1 мкг,пейпептина, О, 1 мкг апротенцна, О, 1 мкг пепстатипа, 0,1 мкг хцмастатица, Кцнетика синтеза белка оболочки в стандартной системе при 25 С представленана фцг,2 (кривая 1)В параллельном эксперименте в установке целрерьпзного действия к 3 мл той же цзц;убдциоцной смеси непрерывно ззопдзздлся раствор (А) со скоростью 06 мл/ч, д продукты реакции отводились из реакционной смеси с той же .скоростью через ультрафцпьтраццонную мембрану ХЪ 1-50. В результате в камеру, содержащую бесклеточную систему трансляцци, непрерьзвно подавались субстрдты реакции (ЛТР, СТР, аминокислоты) ц отводзпцсь иэ нее продукты реакции (АИР, СОР, Р 1, синтезцротздьпзьзй белок. оболочки) . Кннетцка син.теза белка оболочки в такой системе прц 25 С в течение 15 ч представлена нд с 1 иг.2 (кривдя 2).Из сравнения кинетических кривых 1 и 2 цд фцг,2 можно сделать следующие выводы:Стандартна бесклеточцая система трансляции выходит. на плато по синтезу белка через 1;5 ч, Колцчестззо син787 Способ получения пептидов и белковв бесклеточной системе трансляции с использованием матричных РНК с последующим выделением и очисткой конечного продукта, о т л.и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения выхода целевого продукта эа счет уве,личения срока работы системы трансляции, осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси синтезированного продукта, непрерывное восстановление концентрации расходуемых ниэкомолекулярных веществ аминокислот, АТР, СТР, регенерацию АТР и СТР из образующихся АМР и СРР с последующим возвращением регенерированных ЛТР и СТР в систему трансляции. з144теэированного белка при этом составляет 0.,76 пикомолей белка оболочкина 1 пикомоль рибосои.В установке непрерывного дейстния5синтез белка оболочки идет линейнов течение исследованного интервалавремени (15 ч) и количество синтезированного белка за 15 ч состанило40 пикомолей на 1 пикомоль рибосом. 1 рВ целом для предложенной моделиустанонки непрерывного действия эффективность синтеза белка за 15 чвозросла более чем в 50 раз.П р и м е р 2, Синтез белка оболочки фага МЯ 2 на матрице МБ 2 РНКв прокариотической системе трансляции Е, со 1 ь в стандартной системе ив установке непрерывного действия.Раствор (А) содержал 20 мМ Тг 1 нНС 1, рН 7,4, 10 иМ МрС 12, 100 мМ БН С 1, 1 мМ АРТ, 0,2 мМ СТР, 5 мМ креатин фосфата, 1 О мкг/мл кр. фосфат киназы, 25 мМСлейцина с удельной радиоактивностью 348 ики/ммоль и 25 25 мкМ каждой из остальных аминокислот, 3 мл Инкубационной смеси, приготовленной на буфере (А), содержали1 наномоль рибосом 708, 1 нсномоль МЯ 2 РНК, 3,5 ед. Абелковой Зр фракции 8100.В параллельном эксперименте в устанонке непрерывного действия к 3 млтой же инкубационной смеси непрерывно подавался раствор (А) со скоростью 0,5 мл/ч, а продукты реакции. отводились иэ реакционной смеси с той же скоростью через ультрафильтраОионную мембрану РМ. В результате в камеру, , содержащую бесклеточную систему тран сляции, непрерывно подавались субстраты реакции (АТР, СТР, аминокислоты) и отводились продукты реакции (АМР, СРР, Р синтезированный белок).45Стандартная бесклеточная система трансляции выходит на плато по синтезу белка через 2 ч. Количество синтезированного белка при этом составляет 1, 1 пикомоля белка на 1 пикомоль рибосом. Сравнивают кинетику спятза беляоболочки в такой системе при 37 С втечение 15 ч с кинетикой синтеза встандартной бесклеточной системе,В установке непрерывного действияв течение 15 ч синтеэировано 11 пикомолей белка на 1 пикомоль рибосом. Такии образом, предложенный способ синтеза полипептидов в бесклеточной системе трансляцип обеспечивает многократное повышение скорости реакции и функционирование системы в длительном режиме. В результате этого выход целевого продукта повышается в несколько десятков раэ (по сравнению с прототипом). Достигаемая эффективность процесса позволяет испопьэовать способ для препаративного синтеза активных поли- пептидов и белков. Особо важное хозяйственное значение может иметь получение этим способом полипептидов длиной 5-50 аиинокислотных остатков, поскольку производство их химическим путем является крайне дорогостоящим, а для методов генной инженерии - но многих случаях маподоступным. Формула изобретения1441 787 Ф. 8 оставитель О.Скуратовска ехред Л,.олийнык Кор Подписи каз 332 ТирайВНИИПИ Государственно по делам изобретен 13035, Иосква, Ж, Раород, ул, Проектная, 4 Прои приятие,Редактор Т.Пилипенк венно-полиграфиче о комитета СССи открытийшская наб д. ор И.Иаксимиш