Способ получения гликопротеина

СО 1 ОЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСК 9) (11) РЕСПУБЛИК 4 С ОБРЕТЕНИЯ ИСА Н ПАТЕНТ 21) 2745898/28-1422) 19,03.7923) 20.03.7831) 31999/7832) 20.03,7833) ЛР46) 15.10.88,Бюл. У 3871) Моринага Милк Индастри Ко,т.д и Дзе Грин Кросс Корпорейшн(56) Ргосеейзпд оГ где НаТопа 1Асайешу оГ Ясепсе 56, р.488, 1966.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА путем удаления нерастворимыхвеществ из мочи человека, обработкиее хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе,с последующей очисткой гель-фильтрацией на Сефадексе С, о т л и -ч а ю щ и й с я тем,что, с цельюповышения специфичности способа при:стимулировать образование гранулоцитов человека, пробу мочи предварител ухиро Огаса, то, МасаюкиНобуя Янаи ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ но подвергают хроматографии на силикагеле при элюировании 5 Х-ным раство"ром аммиака, элюат нейтрализуют раствором серной кислоты, а затем насыщают до 702 сульфатом аммония, полученный при этом осадок растворяют вводе, затем пропускают через колонку с СМ-Сефадексом С, полученныйэлюат подвергают хроматографии наДЕАЕ-целлюлозе при элюировании0,1 М трис-НС 1 буферным растворомрН 7,0, содержащим 0,3 М НаС 1, полученный после этой процедуры элюатвновь подвергают хроматографии наДЕАЕ-целлюлозе при элюировании в градиенте концентрации раствора хлористого натрия от 0,001 до 0,3 М, элюатподвергают высаливанию сульфатом аммония, полученный осадок растворяютв воде, раствор подвергают гель-фильт.рации на Сефадексе Си адсорбциина конкавалин А Сефароза 4 В с последующим элюированием 50 м растворомМ-метил-й-глюкозида, элюат подвергают очистке с помощью препаративногозонного электрофореза, а целевой продукт получают элюированием 0,025 Мтрис,192 глициновым раствором.Изобретение относится к медицине, а именно к получению гликопротеина,Целью изобретения является повышение специфичности способа при получе 5 нии гликопротеина, способного стимулировать образование гранулоцитов человека НС 3-гликопротеин за счет обработки мочи методом хроматографии на силикагеле, СМ-сефадексе СЕАЕ-целлюлозе, гель-фильтрации наефадексе С, адсорбции на конкаЭалин А Сефароза 4 В с последующейчисткой с помощью зонного электроореза. 15Способ осуществляют следующим образом.Свежую мочу, собранную от нормальйых людей, доводят до рН 6-9, пред йочтительно 7-8, разбавленными раство 20 1 ами кислоты или растворами щелочи и фатем центрифугируют для удаления нерастворимых примесей, содержащихся в моче, Верхний слой контактирует с кремнийсодержащим адсорбентом, таким 25 как силикагель, силикагель-силикат магния, диатомитбвая земля, кварц или бентонит, и адсорбированные составные Части элюируют щелочным раствором предпочтительно при рН 9 или вьппе 30 (щелочный раствор, который используфт для элюации, не является специалььым, это предпочтительно водные расторы гидроокиси аммония, гидроокисиатрия и т,п. в концентрации 0,3- 1,5 М), Затем доводят рН полученного элюата до 7-8 раствором кислоты и добавляют нейтральную соль, например сульфат аммония, до 70% насьпцения и получают фракцию сырого протеина, содержащего НЯ-гликопротеин.Полученную фракцию сырого протеина растворяют вновь в малой порции щелочного раствора, освобождают от низкомолекулярных веществ ультра- Фильтрацией, разбавляют соляным буферным раствором и приводят в контакт с катионным обменником например, карбоксимсетилдекстраном,карбоксиметилцеллюлозой или Фосфоцеллюлозой для удаления примесей, содержащихся в растворе, в условиях нейтрального рН, Сырую Фракцию НС 3-гликопротеина катионнообменник доводят до рН 6- 8 предпочтительно 0,01-0,15 М соляными буферными растворами. Большая часть НС 3-гликопротеина проходит через катионный обменник без адсорб" ции. Концентрированный выходящий продукт уравнивают разбавленным буферным раствором с рН 6-8 и используют в ионно-обменной хроматографии. с анионным обменником, например, ДЕАЕ- целлюлозой, который уравнивают таким же буфером, НЯ-гликопротеин адсорбируется на анионном обменнике. Затем адсорбированный НС 3-гликопротеин элюируют методом градиентного линейного концентрационного элюирования с использованием 0,1-0,3 М соляных растворов, например хлорида натрия.НС.-гликопротецн элюируют при концентрации соли от 0,1 М и вьппе, но полное отделение затруднено, Отбирают фракции выходящего продукта при концентрации соли 0,1-0,3 М и при необходимости подвергают их обессоливанию и концентрационным обработкам. Для того, чтобы элюировать НС 3-гликопротеин из ионного обменникы, можно применять последовательное элюирование соляным раствором 0;1-0,3 М.Для целей дальнейшей очистки объединенные фракции, полученные выше, очищают гель-фильтрационной хроматографией на сильно сшитом полимерном геле, имеющем величину набухания в воде 10-20 мл/г, например БерЬа- йех Сили В 1.оде 1 Ри активные вещества извлекают 0,05- 0,1 М соляным буферным раствором, Фракции относительного объема выходящего продукта 1,11-1,60, предпочтительно 1,11-1,45 отбирают, обессо- ливают и концентрируют или лиофилизуют.П р и м е р 1. Доводят рН 400 л свежей мочи, собранной от нормальных людей, до 8 10%-ным раствором гидро- окиси натрия и центрифугируют с помощью непрерывного центрифугирования при 15000 об/мин при 0 С для удаления нерастворимых примесей, Доводят рН поверхностного слоя до 7с 10%-ным раствором соляной кислоты и пропускают через колонку с силикагелем ( О х 80 см) . Вещества, адсорбированные на колонке, элюируют 40 л 5%-ного раствора аммиака, Доводят.до рН элюированного раствора 7,5 1 н. серной кислотой, добавляют сульфат аммония до 70%-ного насьпцения и отостаивают при 0 С в течение ночи, Осадок отфильтровывают, растворяют в 2 л 5%-ного раствора аммиака, помещают в целлофановые трубки и проводят диа 1431691лиз на фоне 0,05 М фосфатного буферного раствора (рН 6,5), Диализованныйраствор доводят до 10 л таким же буФерным раствором и пропускают черезионообменную колонку СМ-ЯерЬайех :5С(40 х 40 см), которая уравновешена 0,05 М Фосфатным буферным раствором 1 рН 6,5), для адсорбции примесей наионно-обменной смоле, 10 лвьппедшего раствора концентрируют с помощью ультрафильтрационной аппаратуры на полых волокнах 01 АРЬО (фракционируемый мол. вес приблизительно10000). Проводят диализ концентрированного раствора на фоне 0,1 М трисНС 1 буфера (рН 7,0) при 5 С в течение ночи. Диализованный раствор смешивают с 1 л такого же буферного раствора (полученный раствор - образец 1) 20Указанный раствор пропускают через колонку с целлюлозой ДЕАЕ (4,0 хх 40 см), которая уравновешена 0,1 Мтрис-НС 1 буфером (рН 7,0) и промывают колонку достаточным объемом250,1 М трис-НС 1 буфера (рН 7,0), Нанаполненной колонке выполняют последовательное элюирование 0,1 М трисНС 1 буферным раствором (рН 7,0),содержащим 0,3 М хлористого натрия 30(образец 2),ФДиализованный раствор снова пропускают через колонку с целлюлозойДЕАЕ (4,0 х 40 см), которая уравновешена 0,1 М трис-НС 1 буфером (рН 7,0),и на наполненной колонке выполняютэлюирование с линейным концентрационным градиентом хлористым натрием(0-0,3 М) . Активные фракции отбираюти добавляют сульфат аммония до 707насьпцения. Осадки отделяют центрифугированием, растворяют в малом объеме 0,1 М трис-НС 1 буфера (рН 7,0) и.диализуют на фоне этого же буферного раствора (диализованный раствор - образец 3).20 мл диализованного раствора чистят на колонке с Берйайех С(4,0 х х 60 см), которая уравновешена 0,1 М трис-НС буфером (рН 7,0),и отбирают50 полученные выходные фракции при отношениях 7 /Ч 1,11 - 1,45, Объединенные фракции тщательно диализуют на фоне дистиллированной воды при 5 С и диализованный расто 55 вор лиофилизуют с получением 500 мг порошка (этот полуочищенный НС 3-гликопротеин - образец 4). 200 мг полуочищенного НС 3-гликопротеина растворяют в 0,02 М фосфатномбуфере (рН 7,0), содержащем 1,0 Мхлористого натрия, и пропускают черезколонку со 100 мл конкавалина А-ЯерЬагозеВ, которая уравновешена таким же буфером. После тщательногопромывания колонки этим буферомНС 3-гликопротеин элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим50 мл ы -метил-Э-глюкозида и 1,0 Мхлористого натрия. Фракции которыеспособны к эффективному быстромуувеличению и дифференциации гранулоцитов, отбирают и диализуют на фонедистиллированной воды. Диализованныйраствор лиофилизуют (образец 5).Около 56 мг укаэанного лиофилизованного порошка растворяют в 1 мл0,125 М трис-глицин буФера ( рН 6,8),содержащего 107 глицерина. Проводятэлектрофорез полученного раствора при;10 мА в условиях охлаждения с помощьюпрепаративной электрофоретическойаппаратуры, применяющей 8 Е-ный акриламидный гель (рН 8,9, 20 х 25 мм)Фракцию с относительной подвижностью0,46 извлекают 0,025 М трис-глицино-.вым буфером (рН 8,3) и диалиэуют нафоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют с получением около 1 О мг НС 3-гликопротеина(образец 6).П р и м е р.2. К 100 мг порошка ,НС 3-гликопротеина (образец 6), полученного таким же путем, как в примере1, добавляют 100 мл водного раствора, содержащего 57 альбумина сыворотки крови человека и 17. глицина. Полу" ченный раствор стерилизуют с помощью ,фильтрационной системы, снабженной мембранными фильтрами с размером пор 0,45 мкм. По 1 мл стерилизованного раствора асептически вносят в пузырьки, которые стерилиэуют нагреванием при 180 С в течение 2 ч. После лиофилизации пузырьки герметично закры,вают, Таким образом, приготовили95 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал 1 мг НЯ-гликопротеисП р и м е р 3. Таким же способом, как в примере 1, 1 л концентрировакного раствора, содержащего НС 3-глико. протеин, аналогичного образцу 1, готовят из 1000 л свежей мочи, собранной от нормальных людей. К этомуЗаказ 5358/59 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 концентрированному раствору добавляют 10 л 0,1 М трис-НС 1 буфера ( рН 7,01.После тщательного перемешивания разбавленный раствор вновь концентрируют до 0,1 первоначального объема спомощью упьтрафнпьтраннонно аппаРатуры на полых волокнах 01 АРЬО , К концентрированному раствору добавляют5 л 0,1 М трис-НС 1 буфера (рН,7,0) 10Н 5 л суспензии целлюлозы ДЕАЕ, содержащей 300 г сухой основной целлюлозы ДЕАЕ, которая уравновешенаО,1 М трис-НС 1 буфером (рН 7,0).Смесь перемешивают в течение 30 мин, 15отстаивают в течение 10 мин и отфильтровывают под вакуумом на воронке БюхНера, отделяя целлюлозу ДЕАЕ, Отоб"ранную целлюлозу ДЕАЕ промываютО,1 М трис-НС 1 буфером (рН 7,0) и 20новь отделяют фильтрацией таким жеспособом, как указано выше. Далеецеллюлозу ДЕАЕ промывают 10 л 0,1 Мтрис-НС 1 буфером (рН 7,О), содержащим 0,05 М хлористого натрия, и вновь 25отбирают таким же способом, как указано выше. Обработанную целлюлозуДЕАЕ добавляют к 1 О л 0,1 М трис-НС.буфера (рН 7,0), содержащего О,З Мхлористого натрия, и перемешивают, 30чтобы освободить НС 3-гликопротеинот целлюлозы ДЕАЕ. Смесь отфильтровывают таким же способом, как ука 91 бзано выше, и отбирают отфильтрованный раствор. Отфильтрованный раствор обессоливают ультрафильтрацией на полых волокнах 01 АРЬО. Обессоленный раствор лиофилизуют, отбирая 15 г порошка. Порошок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и очищают на колонке ЯерЬадех С(6,0 х 80 см), которую уравновешивают 0,1 М трис- НС буфером (рН 7,0). Отбирают фракции, которые соответствуют отношению Че/70 1,11-1,60. Проводят тщательный диализ объединенных фракций на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор концентрируют с помощью кон" центрационной аппаратуры на полых волокнах П 1 АРЬО (тип ДС) до 100 мл концентрата, содержащего около 3 г сырого НСЭ-гликопротеина, Концентрированный раствор смешивают с 1 г глицина и 5 г альбумина сыворотки, Полученный раствор стерилизуют фильтраци" ей таким же способом, как в примере 1, и асептически заполняют порциями по 2,5 мл пузйрьки. После асептической лиофилизации пузырьки герметично закрывают. Таким образом, получено 40 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал около 3,8 мг НС 3-гликопротеина.