Анионообменный материал для разделения биологических макромолекул и способ его получения

Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет - (32) 290775 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(53) УДК 661.183. 12(088,8) Дата опубликования описания 230981й(72) Авторы изобретения Иностранцы Жан-Луи Тэйо, Мишель ТардиИностранная фирмаЭнститю Мерье(54) АНИОНООБМЕННЫИ МАТЕРИАЛ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯБИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И СПОСОБ ЕГОПОЛУЧЕНИЯ Известный способ получения адсорбента для разделения биологических макромолекул, заключающийся в нанесении путем адгезии на поверхность мелкодисперсного силикагеля типа аэроснла декстрана и последующей термообработки полученного материала при 100-500 оС под вакуумом (1).10Недостатком данного способа является малая емкость полученного материала по отношению к таким компонентам как альбумин или гемоглобин. Наиболее близким к предлагаемому 15 изобретению по технической сущности и достигаемому результату является анионообменный материал для разделения биологических макромолекул, содержащий минеральный носитель, в ка О честве которого используют перлит, активированный уголь, диатомитовую землю, целлюлозу или их смеси, поверхность которого покрыта водорастворимым полимером, выбранным иэ группы 25 алкилениминов или полиалкиленполиаминов с молекулярным весом 1000, а также способ его получения, заключающийся в пропитке носителя водным растворомполимера (2) . ЗО Недостатками известного материала я ляютсяего плохие физико-механические характеристики и малая обменная емкость по отношению к биологическим макромолекулам.Цель изобретения - создание анионообменного материала, обладающего улучшенными физико-механическими характеристиками и повышенной обменной еркостью .по отношению к биологическим макромолекулам,Поставленная цель достигается тем,что анионообменный материал для разделения биологических макромолекул,содержащий минеральный носитель, вкачестве которого используют макро"пористый водонерастворимый окисел,и водорастворимое полимерное вещество,в качестве которого исттольэуют полисахаридные полимеры, берут при следующем соотношений компонентов,вес, ЪтПолисахаридныеполимеры 2, 0-20, 00Неорганическийокисел Остальное,При этом анионообменный материалв качестве макропористого водонерастворимого окисла содержит двуокиськремния анионного типа с удельной поверхностью 5-80 м/г и средним диаметром пор 50-1000 ммк.Кроме того, анионообменный материал в качестве полисахаридных полимеров содержит соединения с молекублярным весом 10 - 10 дальтон, имеющих общую ФорМулуН - (СН),- Н,где й - остаток декстрана, крахмала, целлюлозьг или агароэы фи - целое число от 1 до 70,предпочтительно от 2 до 5;В и Ег 2 водинаковые или различные 15радикалы - СН р( СН 1 СЕЕ З(СКЛОН( - (СЕ)ОН или-СН-СНОН -СН д,Отличительным признаком способаполучения анионообменного материала 20является пропитка макропористого водонерастноримого неорганическогоокисла 1-10-ным водным раствором по-.лисахарида при рН 3-12 и последующаясушка материалов при 40-120 С до постоянного веса.Пористыми неорганическими носителями могут являться окиси алюминия,магния( титана или их синтетическиеили природные производные, такие какстекла, силикаты, каолин и т,д.ЛминированньФ полисахаридный полимер наносится на пористый неорганический носитель путегл импрегнироиания,причем механизм адгезии позволяетуспешно наносить покрытия, на такиепористые носители, как окись алгоминия с неотрицательной ггонерхностью.Выбранные интервалы структурныххарактеристик пористого неорганического носителя являются оптимальными, 4 Отак как в случае больших поверхностейили малых диаметров пор внутренняяповерхность носителя станонится недоступной для аминиронанного полисахаридного полимера, а возможно, также, и для подлежащих разделению макромолекул, В зависимости от ныбранного .варианта изобретения пористый неорганический носитель представляет собой двуокись кремния или окись алюминия и предпочтительно представляет собой пористую двуокись кремния анионного типа, Можно испольэонать также пористые двуокиси кремния, площадь понерхности которых составл)ет соответственно 50, 25 и10 м /г.Аминированный полисахаридный полимер, который используют для импрегнирования, должен относиться к отчетливо анионному типу и иметь хорошие 6 Огидрофильные свойства.Предпочтительным янляетая использование диэтиламинодекстрана (ДЕЛЕ)(соединение с молекулярным весом500000) и четвертичного диэтиламино-, 65 декстрана (ОАЕ), а также соединения, известного под названием крахмал ДЕЛЕ (диэтиламинокрахмал) .Технология способа получения анионообменного материала состоит в следующем.Пористую неорганическую окись в виде сухого порошка вводят в хроматографическую колонку и проводят промывание и гомогенизацию для удаления пузырьков воздуха, пропуская для этой цели кислый раствор, например 0,1 н. соляную кислоту. После этого пропускают через колонку буферный раствор с величиной рН 3-12 до достижения равновесного состояния.Затем через колонку на -холоду или при нагревании пропускают аминированный полисахаридный полимер, растворенный в приведенном выше буферном растворе или в воде, величина рН которой установлена на том же уровне. После этого избыток аминированного полисахаридного полимера удаляют путем промывки указанным выше буферным раствором, а затем раствором соли, например раствором тринатриевой соли лимонной кислоты; отсутствие в конечном элюате аминированного полисахаридного полимера может быть установлено путем электрофореза на ацетилцеллголозе и окрашивании пластинки пунцовым красным или осаждением в присутствии полиакриловой кислоты,Затем пропитанный материал сушат в печи при температуре, находящейЙ н интервале между 50 и 120 С, предпочтительно при температуре 80"С, до достижения постоянного веса, гомогенизируют и просеивают для удаления возможных агломератов. Материал, полученный предлагаемым способом, используют в колонке после предварительного пропитывания при помощи буферного растнора или раствора 0,5 М по цитрату, рН 4 или 0,05 М по цитрату, рН 6,8; для обратимого поглощения биологических макромолекул, например белков, в количестве 40-200 мг белка на 1 г сорбентаПредлагаемый способ позволяет получать материал, покрытие которого, состоящее из аминированйого полисахаридного полимера, фиксируется практически необратимым образом. Так, этот материал можно промывать 0,1 н, соляной кислотой, раствором гидрата окиси натрия или аммиака с концентрацией 0,1 н, без.ухудшения способности к обмену анионов, Если возникает необходимость в регенерации пористой неорганической окиси, то производят обработку материала в значительно более жестких условиях, например при помощи дымящей азотной кислоты.П р и м е р 1. 10 г сферозила ХОСОО 5 помещают в колонку.для хроматографирования, насыпая, непосредственно, сухой и гомогенный порошок, что облегчает заполнение колонки. После этого э колонку при помощи перистальтического насоса вводят 100 мл 0,1 н. соляной кислотысо скоростью подачи 500 мл/ч длятого, чтобы промыть, пропитать колонку и вытеснить все пузырьки воздуха (предпочтительно ведут элюирование в восходящем потоке) . Затем вколонку вводят буФерный раствор свеличиной рН 3-12 до достижения равновесного состояния, что контролируется измерением величины рН и удельнымсопротивлением буферного раствора навыходе из колонки. После этого со 5скоростью 100 мл/ч вводят примерно20 мл 1-ного раствора декстрана(ДЕАЕ) в вышеуказанном буферном растворе или в водевеличину рН которойустанавливают на требуемом уровне. 20После этого избыток не фиксированногодекстрана элюируют тем же буфернымраствором, а затем 0,05 М растворомцитрата с величиной. рН 4 и 0,05 Мраствором цитрата с величиной рН 8,которые пропускают со скоростью1000 мл/ч. Отсутствие декстрана ДЕАЕв конечном элюате определяют методомэлектрофореза. на ацетилцеллюлозе ипо окрашиванию пластинки пунцовымкрасным или методом осаждения в присутствии полиакриловой кислоты. Пропитанный таким образом сорбент сушатв печи при 40-120 СС, предпочтительнопри 80 С, в течение необходимого периода времени (например 15 ч) до дос- З 5тижения постоянного веса. Образовавшийся в результате сушки порошок гомогенизируют и просеивают, если зтонеобходимо, для того, чтобы удалитьвозможные агломераты, а затем используют для изготовления колонки.После заполнения колонки и предварительного промывания буфернымирастворами 0,1 н. по НС 8 или 0,05 Мраствором цитрата с- величиной рН 4,или 0,05 М раствором цитрата с величиной рН 6,8 или 0,1 н. растворомгидрата окиси натрия колонку приводят в состояние равновесия при помощи того же типа буферного раствора,который применяется при хроматограФии этого типа. Емкость колонки в отношении фиксации белков составляетвеличину порядка 40-200 мг/г, в зависимости от условий хроматографиро 55вания.В этом примере декстран ДЕАЕ можетбыть заменен другим аминированнымполимерным полисахаридом, таким каккрахмал ДЕАЕ,60Предложенный анионообменный материал применяют либо для избирательнойфиксации биологических макромолекул,.которые желательно выделить или очистить, либо для избирательного задер" у живания примесей или других белков,присутствие которых является нежелательным.Избирательная фиксация белков легко может быть достигнута путем регулирования величины рН и полярности всоответствии с хорошо известными методами, применяемыми в области использования ионного обмена.В том случае, когда материал фиксирует макромолекулы, которые желательно очистить или выделить, данныемакромолекулы после этого элюируютраствором с подходящей величиной рНи полярностью.В том случае; если материал задерживает примеси, биологические макромолекулы собирают непосредственнов растворе. После этого производятэлвирование раствором с подходящимивеличинами рН и полярности для удаленИя примесей и производят регенерацию материала для последующего егоиспользования,Нижеследующие примеры подтверждают эффективность применения материала для очистки гамма-глобулинов изсыворотки людей или живстных; удаления гемоглобулина при процессеочистки альбумина из плацентарнойкрови и концентрации других белков;концентрирования разбавленного раствора белков в спиртовой среде и удаленияспирта; концентрирования и очисткиальбумина в растворе каприлата натрия; концентрирования и очистки ганглиозидов из водных экстрактов мозга,животных.П р.и м е р 2. Проводят прямуюочистку гамма-глобулинов из сыворотки или плазмы людей и животных, используя 50 г сорбента, приготовленного э соответствии с примером 1 последующей схеме: сначала приводятколонки в состояние равновесия с буферным раствором с величинойрН, 6,8,например между 6,3 и 8 (буферный фосфатный раствор 0,01-0,02 М) или буферный раствор трис-НС 1, 0,05 илираствор хлористого натрия с концентрацией 1-3 г/л со скоростью200 мл см /ч,Затем вводят 50 мл плазмы или сыворотки, предварительно диализованныхпротив буферного раствора, применяемого при хроматографировании, и профильтрованных (средняя скорость подачи 50-100 мл асм/ч)После этого промывают колонки буферным раствором, применяемым при хроматографировании.Далее собирают Фракцию выходногопика, состоящего из чистых гамма-глобулинов, чистоту которых проверяютиммуноэлектрофорезом, с выходом, находящимся в интервале между 50 и 100,в зависимости от применяемых буферныхрастворов. Выход является более высо,ким при величинах рН ниже, чем 6,8867284 или при более высоких ионных силах,но при этом воэникает опасность, чтопродукт будет йедостаточно чистым.Такое получение гамма-глобулиновосвобождает их от пирогенных веществи от антигена, ассоциирующегося сгепатитом В (А НВ), которые могутприсутствовать н сыром исходном материале,Затем элюируют другие белки, удерживаемые в колонке, каким-либо буферным раствором с величиной рН 4 илибуферным раствором, применяемым прихроматографировании, с добавкой 1060 г/л хлористого натрия, или жецитратным буферным раствором 0,05 Мс рН 4-8, Продолжительность цикласоставляет примерно 2 ч и при применении простой автоматики, в один итот же день можно провести десятокциклов, т.е, выход при обработкебудет близок к 10 л сыворотки или 20плазмы на 1 кг пористой неорганической окиси в день.П р и м е р 3. Проводят удаление,гемоглобина при очистке альбумина иэплацентарной крови и концентрирование 25других белков.Исходный раствор готовят путемфракционирования плацентарной кровиспиртом через стадию осаждения массыглобулинон при рН 6,8 в среде20-25-ного зтанола. В этих условияхальбумин, некоторые альфа, альФа глобулины и гемоглобин остаются вверхнем слое раствора. Их собираютпутем центрифугирования на холоду,разбавляют равным объемом дистиллированной воды для того, чтобы снизитьконцентрацию спирта, величину рН устанавливают на уровне между 6 и 7 ижидкость осветляют путем фильтрования через мембраны из сложных эфирон 40целлюлозы.Схема цикла очистки на 50 г сорб.е.н та,Приводят колонки в равновесноесостояние при помощи буферного Фосфат ного раствора 0,01 М или трис-НЮ0,05 М с величиной рН 6-7 (предпочтительно 6,5) при скорости подачи200 мл.см/ч.Вводят при средней скорости подачи-.-100 -мл см 1/ч 1000 мл описанноговыше и подлежащего очистке раствора.Промывают колонки буферным раство-ром, применяемым при хроматографиипри той же скорости подачи. Очищенный гемоглобин удаляют из колонкипри незначительной степени разбаналения, в то время. как другие белки,такие как альбумин, остаются фиксированными на колонке. бОЭлюируют белки, фиксированные на колонкв, в условиях идентичных приведенным в примере 2, причем пик содержит концентрированные белки, практически лишенные гемоглобина, 65 8Продолжительность этого цикласоставляет 4 ч, после которого мож-,но сразу же начать новый,П р и м е р 4. Проводят концентрирование раствора протеинов, разбавленных в спиртовой среде, и удаление спирта из 2 раствора альбумина,соДержащего 10 этилового спирта,по следующей схеме (при использовании1 кг сорбента) .Сначала приводят колонки в состояние равнонесия при помощи 0,01 Мфосфатного буферного раствора с рН 7скорость подачи 200 мл+см/ч. Затемвводят спиртовый раствор альбумина,величина рН которого установлена науровне 7 путем прибавления солянойкислоты или гидрата окиси натрия, взависимости от начальной величинырН, прц средней скорости подачи100 мл см/ч.Таким способом на колонке Фиксируют 200 г альбумина (либо 10 л раст"вора за цикл); если альбумин плохофиксируется на колонке, следует разбавить исходный раствор дистиллированнойводой для того, чтобы снизить ионнуюсилу среды,Затем колонку промывают дистиллированной водой со скоростью подачи200 млесм/ч и проверяют полнотуудаления спирта. Далее элюируют альбумин одним иэ следующих буферных растворов: 0 М раствором хлористого натрия или 0,05 М раствором цитрата с рН 6,8, при этом, как пранило, конечная концентрация альбумина составляет 10- 20, удаление спирта является полным, ныход при таком методе .равняется примерно 100, Этот способ применим для всех белков, изоэлектрическая точка которых ниже,чем 6,5. В случае тех белков, изоэлектрическая точка которых превышает эту величину, метод применим при условии, что неличина рН буферного раствора, используемого при хроматографиронании, будет повышена.Все примеси, присутствующие в этих белковых растворах, также могут быть удалены при условии, что они являются электрически нейтральными (глюциды и полисахариды) или имеют положительный заряд того же типа, что и сорбент. В случае примесей, имеющих отрицательный заряд, может произойти на сорбенте конкурения с отрицательно заряженными белками, которые желательно фиксировать. В этом случае, если степень сродства примеси к сорбенту является меньшей, чем степень сродства белка, и если раствор может быть разбавлен в достаточной мере водой для достижения ионной силы, совместимой с фиксацией белков, на сорбенте можно произвести удаление аке катионов.П р и м е р 5. Проводят к(цент-рирование и очистку альбумина в растворе каприлата натрия из раствора,содержащего 15 г/л альбумина и 3 г/лкаприлата.Схема цикла для 1 кг сорбента следующая.5Колонки приводят в равновесноесостояние с Фосфатным буферным раствором 0,01 М, РН 6 - скорость пода"чи 200 млсм 1/ч,Вводят растворы альбумина и капри Олата, величина РН которых установлена на уровне 6 (в случае чрезмерновысокой ионной силы проводят разбавление водой) со средней скоростьюподачи 100 мл см/ч. 15Пропускают таким рбраэом черезколонку примерно 8 л раствора, непрерывно контролируя фиксацию альбумина и выход каприлата натрия.Затем промывают колонку буферным 2 Ораствором, используемым при хроматографии до тех пор, пока не прекратится,выход каких-либо веществ из колонки,Также можно иммобилизировать раз.личные энзимы, что ведет к образованию следующих материалов.с энзиматической активностью: пепсина, трипсина, хинотрипсина, плазмина, с -аминоадипазы и т.д.Наконец, предлагаемые материалы могут быть также использованы для иммобилизации молекул низкого молекулярного веса, таких как молекулы некоторых аминокислот, или некоторых лигандов, содержащих аминогруппы спиртов или тиоспиртов, или диэпокскд" ных соединений.Так, например, возможно иммобилизировать лизин,и полученный материал может быть использован для очистки Далее элюируют альбумин в соответ ствии с методом, изложенным в предшествующих примерах. При этом получают раствор, содержащий от 10 до 20 альбумина, который после того, как его концентрация будет доведена до 20-ной, содержит меньше чем 2,5 г/л каприлата натрия. Общая продолжительность цикла составляет примерно 4 ч. Из этого примера видно, что метод может быть распространен на очистку и концентрирование различных биологических молекул, имеющих биологические заряды при определенных величинах РН, например нуклеиновых кислот, белков, анионных полисахаридов. 40П р и м е р 6. Проводят концентрирование и очистку гднглиозидов из водных экстрактов мозга животных.Ганглиозиды представляют собой гликолипиды,и в настоящее время.биохимики изучают ту весьма важную роль, которую они играют в физиологии и в патологии на уровне клеточных .перегородок в качестве рецепторов и аффектоРов. Они содержат большее или меньшее количество сиалиновой кислоты и поэтому при величинах РН выше, чу йримерно 3, заряжены отрицательно,Из 1 кг бычьего мозга получают водный экстракт в количестве около 7 л. 55Эти водные экстракты пропускают непосредственно через колонку, заполненную 50 г сорбента, приготовленного по способу, описанному в примере 1, .предварительно приведенно- ц) му в равновесное состояние"при помощи буФерного раствора трис-НС 6 0,05 м, РН 6,8. Скорость подачи составляет 200 млсм 1/ч. Все ганглиозиды в этих условиях фиксируютсяна колонке. Затем проводят предварительную промывку следующими растворами в указанной последовательности: трис-НСР 0,05 М, РН 6,8 р 0,1 М раствором гидрата окиси натрия и водой.После этого проводятфосновную про. - мывку хлороформом, метанолом и водой в соответствующих объемных отношениях (30:60:25), что позволяет удалить многочисленные примеси.Далее элюируют ганглиозиды в концентрированной и очищенной ферме при той же скорости подачи, при помощи смеси: хлороформ-метанол - 0,1 н. со-ляная кислота в соответствующих объемных соотношениях (30:60:25) .После элюирования собранный пик нейтрализуют путем прибавления 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия, выларивают и растворяют в какой-либо хроматографической системе для анализа. Выход составляет 100.В данном разделении анионообменный материал, без какого-либе вреда для себя, может использоваться при много-. кратном переходе от органического растворителя к водному раствору и наоборот, что исключает необходимость стерилизации хроматографической колонки после каждого цикла.Предлагаемый материал можно применять также при очистке антител или антигенов.В этом случае проводят пропитку пористого неорганического носителя согласно изобретению иммобилизированным антигеном или антителом и используют модифицированный таким образом материал для очистки и концентрирования соответствующих антител и антигенов.Так можно иммобилизировать альбумин,альфа-, бета- и гамма-глобулины .тпбдей или животных. Все бактериальные антигены и ядовитые антигены при величине РН 6,8 обладают отрицательными электрическими зарядами. Это имеет место для большинства белков,полисахаридов и известных кулеиновых кислот, таких как гриппозный вирус, вирусы бешенства, чумы, оспы, аденовирус и т.д.867284 Формула изобретения Составитель В,ВиноградоваТехред Ж.Кастелевич Корректор Г.Огар Редактор В.Иванова Тираж 570 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРподелам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская иаб., д, 4/5 Заказ 8109/84 Филиал ППП Патент:ф, г.ужгород, ул. Проектная, 4 или для удаления плазминогена или плазмина, белка крови, обладающего высокой степенью сродства по отношению к лизину.Точно также можно иммобилизировать различные стероиды и использовать также материалы, уже модиФицированные, для очистки их белком переноса. Наконец, возможно иммобилиэировать различные клеточные рецепторы, например ганглиозиды, предварительно дезеацетелированные для деблокирования наиболее реакционно способных аминогрупп и для того, чтобы использовать эти материалы для удзления, нейтрализации или очистки их лигандов,Таким образом, предлагаемый анионообменный материал может найти самое широкое применение в хроматограФическом разделении различных биологических макромолекул.20 1. Анионообменный материал для разделения биологических макромоле кул, содержащий минеральный носительо и водорастворимое полимерное вещество, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью улучшения Физико-механических свойств и повышения обменной ЗО способности материала, в качестве носителя он содержит макропористый водонерастворимый окисел, а в качестве ,водорастворимого полимерного вещества - полисахаридные полимеры при сле" 35 дующем соотношении компонентов, вес ;Полисахаридныеполимеры 2, 0-20,00 Неорганическийокисел (Остальное2. Анионообменный 1 материал поп.1 о т л и ч а ю щ и й с я тем,что в качестве макропористого водонерастворимого окисла он содержитдвуокись кремния анионного тпа судельной поверхностью 5-80 м /г исредним диаметром пор 50-1000 ммк.3. Анионообменный материал попп, 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в качестве полисахаридныхполимеров он содержит соединения смолекулярным весом 10 - 10 дальтон, имеющих общую Формулук,В - (СН )-И12 где Р " остаток декстрана, крахмала, циллюлозы или агорозы;п - целое число от 1 до. 10 и Н В 2 - одинаковые и различныерадикалы - СНЗ, СНСНЗСН ОН, - (СН ) ОН илиСН -СНОН-СН4. Способ получения анионообменно" го материала по п,1 заключающийся в том, что макропористый водонерастворимый неорганический окисел пропитывают 1-10-ным водным раствором полисахарида при рН 3-12 и затем сушат прп 40-120 С до постоянного веса.Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе1, Авторское свидетельство СССРР 467883, кл. С 01 В 33/14,1972.2, Патент Великобритании У 1043616, кл. С 1 А, 1964.