Способ определения проницаемости мембраны эритроцитов и концентрации кальция в цитоплазме

Номер патента: 1429020

Авторы: Орлов, Покудин, Постнов

ZIP архив

Текст

(21) 3 С 22) 0 (46) 0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ 947900/28-144.07,857. 10.88. Бап.37 (7 1) Центральная научно-исследовательская лаборатория Четвертого главного управления при Министерстве здравоохранения СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ И КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ В ЦИТОПЛАЗМЕ (57) Изобретение может быть использовано для оценки состояния мембранных процессов при гипертонической болезни Цель изобретения - повышение точности и упрощение способаСуспензию эритроцитов инкубируют до и после до" бавления раствора 9-аминодиметилкарбокси-метокси-(3-окси-аминометилкарбоксифенил) -хинолина в диметилсульфоксиде. Затем в суспензию добавляют изотоп Са в количестве 1,0Х 4,0 мкКи/мл. Регистрируют содержание кальция в эритроцитах через 15-20 и 240-260 мин инкубации. Определяют удельную активностьса в среде инкубации и объем эритроцитов. Затем рассчитывают проницаемость мембраны и концентрацию. свободного кальция в цитоплазме. При гипертонической болезни а скорость входа кальция в эритроцитыи увеличена на 2573 табл.Изобретение относится к медицине и жет быть использовано для оценки со тояния мембранных процессов при г ертонической болезни,Целью изобретения является повышение точности при упрощении способа за сет применения изотопа Са в,кон.центрации 1,0-4,0 мкКи/мл и регистрации его в эритроцитах через определен.10 не сроки инкубации,Способ осуществляют следующим обр зом.Из взятой для биохимического анал за крови отбирают 5 мл и центрифу г уют при 1000 я в течение 10 мин.азму и клетки белой крови удаляют.ставшиеся эритроциты трижды промывают при тех же условиях центрифугиования в среде следующего состава; 20 50 мл БаС 1 и 5 мм Ба-фосфатного .буера (рН 7,4). К 1 мл упакованных ритроцитов добавляют 4 мл среды, соержащей 145 мМ БаС 1, 5 шМ КС 1, 1 шМ С 3 1 мМ СаС 1 10 мМ глюкозы, 25 мМ БаНРО, 10 мМ трис-ЫС 1 .буфера (рН 7,4), и 1 г на 100 мл среды сыороточного альбумина (7 Фракция). Суспензию эритроцитов инкубируют во течение 20 мин при 37 С, после чего до- добавляют, например, 50 мМ раствора. ,9-аминодиметилкарбокси-метокси- (3-окси-аминометилкарбоксифенил)- хинолина в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 150 мкМ, Суспено, зию эритроцитов ннкубируют при 37 С в течение 90 мнн. Нагруженная указан,ным соединением суспензия эритроцитов может непосредственно использоваться для дальнейшего анализа, а может и 40 храниться при 0-2 С в течение 2 сут без изменения исследуемых параметров.Суспензию в количестве 1,5 мл центрифугируют при указанных условиях и дважды промывают в среде, содержащей 145 мМ БаС 1, 5 мЫ КС 1, 1 мМ МяС 1, 1 мМ СаС 1, 10 мИ глюкозы, 1 мМ БаНРО, 10 мМ трис-НС 1 буФера (рН 7,4), ресуспенцируют в той же среде до конечного объема 1,5 мл и инкубио 50 руют при 37 С в течение 20 мин. В полученную суспензию добавляют радиоактивный изотоп Са в количестве 1,0- 4,0 мкКи/мл, Уменьшение радиоактивности меньше 1, 0 мкКи/мл приводит к снижению точности измерения, так как количество изотопа, накапливаемого в клетках, недостаточно для достоверной регистрации на жидкостно-сцинциляционинкубацииаккумуляциет насыщениции, Колич чено 15 мин. Кинетика эритроцитами достига мин (4 ч) инкубарадиоактивного кальв клетках, к этому ют для расчета конного кальция в цитограни4 кСа ство щеес ольз вобо ция, находя времени исп центрации сплазме.Для опремембраны эрпользуют фо деления прониитроцитов длрмулу емости кальция исгде К - проницаемость мембраны эрироцитов, нмоль/л клеток в1 мин;А - радиоактивность ф Са в эритроцитах через 15 мин инкубации, срв;а - удельная радиоактивность45Са в среде инкубации,срш/нмоль;7 - объем эритроцитов в пробе,л;- время инкубации, мин.Для определения концентрации каль ция в цитоплазме используют формулу тВ А юц 2+оном спектрометре. Увеличение концентрации более 4,0 мкКи/мл существенно не повышает точность измерения, но приводит к повышению общего фона радиоактивности на рабочем месте и к повышению стоимости каждого реализа.45Суспензию эритроцитов, содержащую 4 Са, инкубируют при 37 С. Через 15 и 240 мин отбирают по 200 мкл суспензии, переносят ее в 1 мл среды, содержащей 150 мМ БаС 1, трис-НС 1 буфера (рН 7,4; 0-2 С) и О, 1 мМ ЭДТА, и центрифугируют при указанных условиях. Полученный осадок эритроцитов вновь промывают при тех же условиях и обрабатывают путем добавления 0,4 мл, 0,253-ного раствора тритона Х 100 и 0,5 мл 107-ного раствора трихлорук" сусной кислоты. Белки осаждают при 2000 я в течение 10 мин, а 0,8 мл супернатанта переносят в диоксановый сцинцилятор и определяют радиоактивность, Указанные 15 и 240 мин являются оптимальным временем выборки, так как кинетика аккумуляции эритроцитами Са носит линейный характер вплоть до 30 мин инкубации. Поэтому в процессе определения проницаемости мембраны зритроцитов для кальция время.3 142902 где ГСа 3- концентрация кальция вэритроцитах, нМ; К,=115 нИ - константа сродства кальция к 9-аминодиметилкар-5бок си-метокси- (3 окси-аминометилкарбоксифенил)-хинолину;А - радиоактивность 4 Са в24 о ф"эритроцитах через 240 мин 10инкубации, срш 3В - концентрация 9-аминодиметилкарбокси-метокси 2-(3-окси-аминометилкарбоксифенил)-хинолина 15нмоль/л клеток.Полученные величины скорости аккумуляции и свободной концентрации кальция в цитоплазме эритроцитов используют для оценки состояния мемб раны.П р и м е р 1. Воспроизводимость метода показана в результате проведения следующих исследований. У одного пациента в течение месяца делались 25 заборы крови и определялись величины проницаемости мембраны эритроцитов для кальция и концентрация свободно. го кальция в цитоплазме.В табл. 1 приведены результаты проницаемости мембра 1 щ.эритроцитов для кальция (К) и концентрация кальция ( ГСа 3) в цитоплазме эритроцитов. Добавки онтрольбез добаок) 50+30 Хин 27+8 0 мкМ рифторпеазин30 мкМ) 619+97 138+7 (0,01 (0,005 а б л и ц а 1 0,001 0,0 а Из этих. результатов видно, что предлагаемый метод позволяет выявит0 влияние лекарственных препаратов на О 2 3 7 5 3 М+ 0+30 3+3 55 з анализа табл следует выводки достоверноизмерения опрео том, что статистич достигаемый результа приведены в табл змерение К,нмоль/л клеток в 1 мин04деляется с погрешностью не выше 107,для К и 153 для Са . Погрешностьпри определении величины К и Са 3Мс помощью известного метода составляет 60-70 и 30-40 Ж соответственно(1-3),П р и м е р 2. Использование предлагаемого метода для оценки эффективности действия лекарственных препара"тов (хинидина и трифторперазина) насостояние мембраны.В табл, 2 приведены результатывлияния хинидина и трифторперазина напроницаемость мембраны эритроцитовдля кальция и концентрацию кальцияв цитоплазме эритроцитов.Т а б л и ц а 2 Число К,нмопь/л Са наблю- клеток в нМ дений 1 мин состояние мембраны при концентрациях 10 мкМ (хинидин) и 30 мкИ (трифторперазин). При использовании прототипа испытание этих веществ невозможно,так как они обладают собственной флуоресценцией.Эффективность метода заключается в том, что его применение позволяет выполнять исследование проницаемости мембран с высокой точностью. Обследовано 35 больных гипертонической болезнью, 12 больных с вторичными формами артериальной гипертензии и 46 лицконтрольной группы, не имеющих симптомов артериальной гипертензии и указаний .на наследственную отягщенность этим заболеванием.Результагы измерений1429020 6а 3 и упрощения способа, добавляют изо"топ РСа в концентрации 1,0- Са 1 4,0 мкКи/мл, регистрируют содержание нМ5его в эритроцитах через 15-20 мини 240-260 мин инкубации, определяютудельную активность в среде иукубациии объем эритроцитов, при этом проницаемость мембраны определяют по фор 1 О муле98+5 Таблиц ЧислонабСкоростьвходакальция,нмоль/л,клетокв 1 мин ппа больлюдений Контрольная 980+41 А 1 у.оа"Ч С й Б ьные гипер" т нической бол знью 1225+50 110+ Б ьные втор ной гип ртензией 1.5 2 7+ 1030+47 р0,001. На основе статистического анализа в дно, что скорость входа кальция в э итроциты больных гипертонической б лезнью увеличена по отношению к к нтролю на 257 (р ( О, 001), что указ вает на существование структурноФнкциананыщх нарушений. Так как отчий по этому параметру не обнаружеу больных вторичными формами гипернзии,то можно заключить, что изженные материалы могут быть испольваны для диагностического теста наедмет разделения гипертоническойлезин и вторичных форм гипертензии. а концен 5 цитоплазгде0К.1 из обре н ости ром я сти оставитель А. Пецехред МаДидык Корректор В Редактор С, Пекарь раж 847ственного комитета бретений и открытий -35, Раушская наб.,Заказ 5118/41 ПодписноеСР ВНИИПИ Госуд по делам и 13035, Москва, ственно-полиграфическое предприятие, г, ужгород,Проектная,Прои Способ определения проницае мбраны эритроцитов и концентьция в цитоплазме путем нас леток высокоселективным хелат льция, о т л и ч а ю щ и й с ем, что, .с целью повышения то проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин;радиоактивность Са в эрит 45роцитах через 15-20 мин инкубации, срш;удельная активность Са в среде инкубации, срш/нмоль; объем эритроцитов в пробе, л; время инкубации, мин, трацию свободного кальция в ме определяют по формуле ь+1 А и аа2 а -2 ьСа- концентрация свободногокальция в цитоплазме,нМ;5 нМ - константа сродства кальция к 9-аминодиметилкарбокси-метокси-(3-окси 4-аминометилкарбоксифенил)-хинолину;2 айу- радиоактивность феса вэритроцитах через 240260 мин инкубации;В - концентрация 9-аминодиметилкарбокси-метокси(3-окси-аминометилкарб . оксифенил)-хинолина,нмольл клеток в 1 м и,

Смотреть

Заявка

3947900, 04.07.1985

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ ЧЕТВЕРТОГО ГЛАВНОГО УПРАВЛЕНИЯ ПРИ МИНИСТЕРСТВЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ОРЛОВ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ, ПОКУДИН НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ, ПОСТНОВ ЮВЕНАЛИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

МПК / Метки

МПК: A61B 6/00, G01N 33/48

Метки: кальция, концентрации, мембраны, проницаемости, цитоплазме, эритроцитов

Опубликовано: 07.10.1988

Код ссылки

<a href="https://patents.su/4-1429020-sposob-opredeleniya-pronicaemosti-membrany-ehritrocitov-i-koncentracii-kalciya-v-citoplazme.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения проницаемости мембраны эритроцитов и концентрации кальция в цитоплазме</a>

Похожие патенты