Способ получения ноурзеотрицина

.х;:ЯЕЮ 3:;: ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН г,11емт;гУ 4 Ф,ФФ ВТОРСКОМУ С ТЕЛЬСТВУ,еь нафарм Гунтер, ид, Редер Уте, Верн, Гроссе Бокер ГаОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОУРЗЕОТРИЦИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения - повышение производительности способа. Сущность способа сводится к тому, что культуру-продуцеит на первой стадии ферментации выращивают в условиях лимитации по фосфору. Для этого концентрацию фосфата в питательной среде устанавливают ниже 1 О мг/л. В процессе ферментации регулируют величину рН, поддерживая ее на уровне 5,0 - 6,5. Концентрацию углерода и азота в процессе ферментации поддержи вают в пределах 5 - 15 г глюкозы/л среды и 0,015 - 0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление устанавливают на уровне Ж 30 - 6000 от полного насыщения среды. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 8000 11000 мкг антибиотика/мл культуральной жидкости.Изобретение относится к новому способуферментативного получения ноурзеотрицина.Ноурзеотрипин является антибиотиком стрептотрициновой группы, который после его назначения в эрготропных дозах вместеГ с кормовыми рационами сельскохозяйствен но-полезным животным обуславливает ускоренный прирост живой массы, а также Одновременно уменьшение затрат корма. Ноурзеотрицин используют для животноводческого производства, а также для фармацевтической и комбикормовой промышленности.Антибиотик ноурзеотрицин, изолированный из культуры варианта штамма Ягер 1 огпусез поцгзе АТСС 11455, активен п чего в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также в отношении микобактерий.Образующий антибиотик ноурзеотрицин штамм стрептомицетов под названием Ягер 1 огпусев.поцгве 21 МЕТ ЗА 3890 Ь депонирован в млгс ,.. , . траль.: з .1(стит- та микробиологии и экспериментальной терапии Академии наук ГДР.По известным из литературы способамкультивирование штамма осуществляют в аэробных условиях. Для этого лиофилизи рованный на земле споровый материал этого , штамма стрептомицетов переносят на соот ветствующие агаризованные питательныесреды. После 6 - 1 О-дневного инкубирования при 28 - 30 С проросший спорулирующий мицелиальный газон используют для засева жидких стерильных питательных сред, засев можно осуществлять также непосредственно при помощи консервированного лиофилиза цией на желатине глубинного мицелия ноурзеотрицинообразующего штамма стрептомицетов.Жидкие питательные среды для глубинного выращивания гюсевного материала содержат в качестве субстратов источники углерода и азота, а также неорганические соли. В качестве источника углерода используют глюкозу и/или глицерин. В качестве источника азота применяют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или аммонийные соли. Наиболее благоприятная для выращивания посевного материала кислотность имеется в начале культивирования в пределах рН 6,0 - 6,7. Инкубирование проводят при 28 - 30 С в течение 24 - 48 ч. Получаемый таким образом посевной материал служит для засева ки)кх стерильных питательных сред для питания основной культуры. Такие питательные среды состоят из источников углерода и азота, а также из неорганических солей. В качестве источника углерода. используют кукурузный экстракт и/или глюкозу. В качестве источника азота применяют, в частности, соевую муку, различные аминокислоты и/или ам монийные соли. Наиболее благоприятная для образования антибиотика кислотность составляет в начале ферментации рН 6,0. 15 20 25 30 35 40 50 55 7,5. Культивирование осуществляют при 26- - 32 С, предпочтите)Но 28 - 30 С, в течение50 ч.Глубинное культврс,;а(е штамма 1 гер 1 оп(усев поцгзе 71 МЕТ,)А 3890 Ь осуцествляют известных Ооразом па кэалке или в ферментаторах с пере.,;ешиванием и аэрацией без прибавления субстратов или регулирования значения рН.При этом известно, что сравнительно незначительное ноурзеотрицинообразованис на первоначальной ферментационной среде может увеличиваться в 5 - -10 раз в известных технических условиях, если в начале выращивания основной культуры прибавляют аминоарилка-,боновые кислоты, в частности 5 - 10 ммоль/л о-аминобензоинои кислоты 1 Вгс)ег Н, ип(1 Тпгшп Н.: 81 гпца(оп о Поцгэео 1 Ьпсп рго 1 С 1 Оп Ьу агп 1 поЬет.о 1 С ас 1 з. 1 П: Него 1 М пг 1 йаЬге 1 Х.: Ап Ь(о 1 Сз-Адчапсез ,ггезеаСЬ, ргоцс 1 юп ;1 д с 1 пс иве. 1.ог 51 оп,96, р. Я 4. Ьв 587;,Однако фермгнтативюе производство ноурзеотрицина с использованием аминоарилкарбоновых кислот, котого, ка с известно, хотя и позволяет значительно увеличивать выход ферментации, но, в частности, в отношении затрат, стерилизации и проблем,ф связанных со сточными водами, имеет недо статки, которые мешают внедрению способа в промышленное производство. Известно также, что на биосинтез большинства вторичных метаболитов отрицательно влияет избыточный фосфат (,Маг и 1. 1, ппд Вегпаи А. 1: Соп 1 го 1 О 1 ап 1- Ьо 1 с Ьозуп 1 Ьезз. - МсгоЬюЬ Ее 44, 230 Ьв 251 11980). Поэтому микробиологческие процессы ферментации для получения вторичных мгтаболитов, например антибиотиков, проводят при концентраци,х фос;.)ата суооптимальных для роста Образователя.11 ля ферментации в технических масштабах в целях получения вторичых метаболитов используют, как правило, комплексные компоненты питательной среды растительного и животного происхождения, такие, как крахмал, соевая мука, кукурузный экстракт, мел.(сса, мясной эк,"г;)ак( ",р Такие Коц(ЛЕК ПЫЕ КО,ПОЕПТЫ и;)Н 1 г Ь(о Сргд, имеют по мере происхождения и предварительной ооработки различное содержание оощего фосфатя с различной биологической доступностью. Часть доступного фосрата имеется в ферментационной среде в форме растворимого фосфата. Это обстоятельство принцпиалыО зат рудняе) с. апд.1)тизац.ю питательньх сред.Однако начальные кснце:тр Ии растворимого или доступного фосфата имеют Оешаюцее значение для ферментат:.)ного вы. хода ождаемого вторич когоетаболита, ПОскольку ОИОеделенное кОличествс фос)ата необходимо для роста микроорг)низ:, а - продуцента, а слип(ком высокие начальныеконцентрации фосфата подавляют образование вторичного метаболита.При улучшении микробиальных способовполучсния вторичных метаболитов питательную среду и микроорганизм - продуцент приспосабливают друг к другу утем взаимного модифицирования так, чтобы между обоими противодействующими регулирующими факторами воздействия фосфата уста- НОВИЛСЯ КОМПРОМИСС.Однако путь постепенного повышения продуктивности связан с затратами времени и расходами.Кроме того, известно, что наряду с регулирующим воздействием на процесс путем изменения состава питательной среды выход ферментации можно улучшать также путем управления ферментационным пооцессом, предпочтительно управления в реальном масштабе времени (Ьц 1 а 1 зсй В. А. ц. 1 еве 1 т 1 апп С 1.; АШогпа 11 зс)зе Рагагг 1 е(егегЬзэцщ Ье 1 п 1 цв 1 г 1 е 11 еп Геггпе 1 а 1 Опеп. - Спегг 1 е-Тес)эпй 20 б, 261 (1977).В случае использования режима управления в реальном масштабе времени, необходимого для эфрективного зедения процесса ферментации, трудность заключается в том, что вместо концентраций субстратов, чаще всего определяемых только дополнительно трудоемклм химическим анализом, приходится прибегать к измерению принятых в ферментацлонной технике непрерывно определяемых общих параметров процес са - рН, рО, количества дозируемых добавок, состав отходящих газов, теплообразовапие - как первичных регулируемых параметров процесса.Цель изобр,.тения -- повь:шение производительности способа.Сущость изобретения сводит" я к сле- ДУ 1 О 11 Е Х У.В основу изоорете 11 ия положена задачапредставить техически удобный способ, который путем ведения процесса с лимитированием о предельным значениям и уве личения времени продуктообразования позволял оы осуществить про лышленное производство ноурзеотрицин с высоким обьемновоеменньм аходом ф рметации.Рег;ирэуемая в заданных ,слэв.11 х за.чений р 1 в пределах 7,2 - -Я,л термостеоилизация культуральной среды, раздельная сте 1;илизацля ком 011 етов (г;юкоза и сульфат аммония); лимитированное по скорости дозированное прибавление субстрата (прибавлене извне ил высвобождение субстра тов из компонентов питательных веществ), регулирование заданОго значеня рН в пределах 5,0 - 6,5 во время ферментации особенно эффективно влияют на метаболичеси активности ноурзеотрицинообразуюп;их культур ,дыхание, глюкозньй об.,:ен, азотый обмен, антибиотикообразование).При этом особое за ение имеет, что напротяжении всего периода ферментацки отношение коценграций углерода к азоту составляет не менее 5 - 15 г глюкозы/л к 0,015 - 0,2 г аммонийного азота/л среды.За счет заданного режима стерилизации с начала ферментации обеспечивается лимигированое по скорости высвобождение фосфатного буфера в пределах 0,1 - 10 мг/л предпочтительно из комплексных азотных компонентов питательной среды. Этот предел концентрации особенно выгодно влияет на необходимый для биосинтеза антибиотика ход обмена веществ (С:Х) в указанном соотношении концентраций.В тесной связи с эффективной метаболической активностью в процессе ферментации следует рассматривать регулирование рН в пределах 5.0 - 6,5. Необходимый и выгодный для биосинтеза антибиотика ход обмена веществ особенно активируется в этих пределах.Для сохранения требуемого соотношения концентраций глюкозы/азота необходимо дозировать сульфат аммония до достижения физиологически оптимального диапазона рН.Неожиданно было найдено, что соответствующий интервал заданных зачений регулирования рН културальной жидкости устанавливается в пределах эффективных с точки зрения физиологического регулирования рН 5,0 - 6,5 при прибавлении раствора гидроокиси аммония соответствующей концентрации, а вместе с тем гарантируется концентрация азота д,1 я соотношения концентрации глюкозы/азота.Способ ведения процесса обеспечивает лимитированное по скорости высвобождение фосфатого б фепа.Таой способ регулирования процесса поз вол яет через 120- - 140 ч фермента ци и при парциальнох давлении кислорода р 02 в пределах 30 - -80,"4 э, предпочтительно 40 О, обеспечить биологическую активность, дающую 8- - 11 кг ноурэеотрицина а тонну культу э ал ь о Й ж идк ости.Пример. Суспензия лиофилизированного консервного мицелия в физиологическом растворе поваренной соли, полученного от штамма - продуцента Ягер 1 огпусев поцгзе 1, служ 1 г в качестве инокулюма для ервого глубиного пассажа.Питательная среда содержит, г/л: глюкоза 15; соевая мука 15; карбонат кальция 1,0; хлорид натрия 5,0; дигидрофосфат калия 0,3; водопроводная вода до 1000 мл, рН 6,5 - 6,9 (разливать по 50 мл в 500-мл колбы на качалке).Стерилизацию среды производят при 120 Г в течеие 35 мин.После 48-часово:о культивирования при 28 С н ротационной качалке культивируют 2-й глубинный пассаж (разлив 250 мл, 2000 -- мл колоы на качалке) В соотношении 1 ч инокулюма к 25 ч питательной среды в течение 24 ч на ротационной качалке, 600 мл 2-го глубинного пассажа используют1423588 СоставительРедактор Н. Киштулинец Техред И. Верес Корректор О. КравцоваЗаказ 4607/30 Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 для засева 800 л среды посевного ферментатора.Питательная среда содержит, г/л: глюко за 15; соевая мука 15; дигидрофосфат калия 0,3; хлорид натрия 5,0; карбонат кальция 1,0; антафрон 5,0; подсолнечное масло 37,5.Значение рН устанавливают перед стерилизацией на 7,6, после стерилизации оно составляет 6,8 - 7,0. Стерилизацию осуществляют при 120 С в течение 60 мин.После ЗО-часового культивирования при 28 С потребляется около 60 мг растворимого фосфата на литр, причем образуется 12 - 15 г биомассы на литр.Количество инокулюма в 800 л достаточно для засева около 8 мз производственной среды основной культуры.Питательная среда производственного фермснтатора содержит, г/л; картофельный крахмал 32,0; соевая мука 15,0; хлорид натрия 1,0; карбонат кальция 6,0; сульфат цинка 0,5; сульфат магния 2,0; подсолнечное масло 3,0; антафрон О,З; глюкоза 10 - 35; сульфат аммония 2 -1,Компоненты глюкозы и сульфата аммония прибавляют к питательной среде после раздельной стерилизации (120 С, 30 мин). Стерилизацию среды производят при 115 С в течение 60 мин, причем до начала устанавливают значение рН 7,8, которое по окончании стерилизации достигает значений в пределах 7,2 - 8,2.Пополненная среда достигает значения рН в пределах 7,0 - 7,4. Ферментацию производят при 28 С с соотношением аэрации 60,3:1 (мз воздуха;мз культуральной жидкости в 60 Уо)Если предельные значения не достигаютвеличины 5 г/л для глюкозы и 0,2 г/л для аммонийного азота, эти компоненты прибавляют как 50 Я-ные стерильные растворы, пока культуральная жидкость не достигает рН 5,2 при значении аммонийного азота свыше 300 мг/л.В дальнейшем прибавление аммонийногоазота осуществляют дозированным прибавлением аммиачной воды при постоянном рН 5,5. Через 130 ч ферментации достигается биологическая активность порядка 800 - 11000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл культуРальной жидкости.формула изобретенияСпособ получения ноурзеотрицина путемкультивирования штамма Югерогпусез поцгве 1 Х 1 МЕТ,)А 38906 в питательной среде, 20 содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные и органические добавки, в условиях аэрации и перемешивания, отличаюи 4 ийся тем, что, с целью повышения производительности способа, в начале ферментации устанавливают концентрацию растворимого фосфата в питательной среде ниже 10 мг/л, в процессе ферментации поддержи вают величину рН в пределах 5 О - 6 5, отношение концентраций углерода и азота поддерживают в пределах 5 - 15 г глюкозы/л среды и 0,015 - 0,2 г аминного азота/л среды, а парциальное давление кислорода устанавливают на уровне 30 - 60 о от полного насыщения среды.