Способ определения активности изопероксидаз

(19 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ЕТЕПЬСТ К АВТОРСКОМУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ Ы ОТКРЫТИЙ(56) Бояркин А. Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы. - Биохимия, 1951, т. 16,4, с. 352 - 357.Кабжанова С. Б. и Перуанский Ю, В. Состав и активность изозимов пероксидаз и эстераз зерна гетерозисных гибридов кукурузы. - Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана, 1975,9, с. 33 - 37.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОПЕРОКСИДАЗ(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биологической химии и может быть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека. С целью повышения избирательности и чувст 4 С 12 М 9 42 6 01 М 33 вительности определения, электрофоретическое разделение белков из вытяжки пероксидаз, полученных из проростков пшеницы и кукурузы, осуществляют на 2-х параллельных дорожках в полиакриламидном геле толшиной 1 мм. Полученную гелевую пластинку разделяют на 2 части таким образом, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают 30 мин в 0,02 о-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М ацетатном буфере рН 4,7, а затем до появления синих полос в 0,1 О 4-ном растворе перекиси водорода. Другую часть геля окрашивают на белок серебряным реагентом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой электрофоре- Ж тической зоне по площадям пиков. Преимущество способа закпючается в упрощении Цф определения активности изопероксидаз за счет исключения многоэтапной очистки и получении информации об удельной активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многокомпонентной смеси изоферментов из вытяжки проростков растений. 3 табл.фь1423587 абл Расчет удельной активност остков кукурузы нодных изопероксидаз пр Днепровский 247 14 В Б пика (мм )при проявлении на активность изо Я пика (мм )при окрашивании на белоксеребрением ЭП изо Удельнаяактивностьпкат, мкг Количество белка, мкг Актив ность зим пкат пероксиддз 1,6 2,7 1,70 4,6 1,87 7,4,57 а н и е. Б - площадь пика", пкат - пикокаталы, ОЭП - относ тельная электрофоретическая активность. и 1РЬобретение относится к молекулярной биологии и биологической химии и может быть использовано для изучения структуры и функции ферментов, а также для разработки экспресс-методов диагностики состояния растений, животных и человека. Цель изобретения - повышение избиральности и чувствительности определения.Сущность изобретения заключается в том, о после электрофоретического разделения 10 полиакриламидном геле удельную актив- ость изопероксидаз и содержание в нихлка определяют десинтометрически после бработки соответствующими реагентами и асчет удельной активности проводят на осове калибровочных графиков, построенных о стандартному препарату пероксидазы,Пример (. Навеску 0,2 г растительного атериала растирают в 1 мл холодного трисицинового буфера, рН 8,3, содержащего 00 сахарозы, в фарфоровой ступке в теение 3 мин, выдерживают в холодильние (4 - 6"С) в течение 30 мин и центрифугиуют при 10000 д в течение 20 мин. Полученную вытяжку используют для электрофоретического разделения изопероксидаз,В карман геля наносят строго определенное количество белкового материала (в пределах 25 - 35 мкг). После электрофореза гель разрезают так, чтобы две пробы одного и того же образца оказались в двух разных половинках геля, Одну из них выдерживают 30 мин в 0,0200-ном бензидине солянокислом, приготовленном на 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,7, а затем до проявления синих полос в 0,100-ном растворе перекиси водорода. Другую часть геля окрашивают на белок серебряным реагентом. Затем обе части геля сканируют с помощью лазерного денситометра и рассчитывают площадь получаемых пиков. По калибровочным графикам, составленным по стандартному препарату пероксидазы из хрена, определяют активность каждого изофермента в пикокаталах, а также количество белка в мкг в зонах, проявивших пероксидазную активность с последующим расчетом удельной активности в пикокаталах на мкг белка (табл. 1, 2, 3).1423587 Таблица 2Расчет удельной активности ансдных изопероксидаз листьев озимойпшеницы Альбидум 114 Я пика, мм,при окрашивании на белок серебреЯ пика, ммпри проявлении на ОЭП изозима 1 И 1- п/п Активность(пкат) Количество белка, мкг Удельнаяактивность,пкат, мкгпероксидазную активнием ность 1,12 2,10 11,56 41,45 15,31 1,75 12 2,10 1,20 1,05 1,84 2,66 2,17 15,05 36 2,00 2,4 2,93 40 1,50 2,00 1,65 16,64 П р и м е ч а н и е. Я - площадь пика, пкат - пикокаталы. Таблица 3 Соотношение относительной активности и удельной активности изопероксидаз Е и к их суммеКукуруза Пшеница ОЭП изо- Относитель- Удельная ОЭП изо- Относитель- Удельнаязима ная зима ная 12 22 46 36 40 16,64 риламидном геле с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что, с целью 45 повышения избирательности и чувствительности определения, полученную гелевую пластинку разделяют на две части так, чтобы параллельные пробы оказались в разных половинах геля, одну из которых обрабатывают реагентом для выявления зон фер ментативной активности, а другую прокрашивают на белок серебряным реактивом, после чего обе половинки геля десинтометрируют и определяют содержание белка и удельную ферментативную активность в каждой электрофоретической зоне по площадям пиков. Преимущество предлагаемого способа заключается в упрощении способа определения активности изопероксидаз и активности каждой изопероксидазы, входящей в состав многокомпонентной смеси изоферментов из вытяжки проростков растений. Формула изобретения Способ определения активности изопероксидаз, включающий инкубирование проб в растворах субстрата и перекиси водорода, электрофоретическое разделение в полиакВНИИПИ Заказ 4607/30 Тираж 520 ПодписноеПроизводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 24,86 21,96 30,06 23,12 20,33 43,52 33,23 36,13 27,46 29,0818,8122,9429,16 12,60 27,10 20,70 22,50 17,10 11,56 41,45 15,31 15,05