Способ получения зеаксантина

О П И С:А И:-И-."Е ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскикСоциалистическихРеспублик(32) 27,10.71 51) М С 12 а Ь Государственный комитет Совета ееинистров СССР оо делам изаоретеиий и открытий) Опубликовано 30.09,77. БюллетеньЗб б) Дата опубликования описания 29.09.77(Швейцария к, Дав Трль странная фирма з Продюн Нестле, С.А, ейцария) Ин(54) ПОЛУЧЕНИЯ ЗЕАКСАНТИНА 1Изобретение касается способа получения жен. того пигмента, именуемого зеаксантином или 3, 3- дигидрокси . Р . каротина, путем культивирования микроорганизма, производящего зто вещество.Такой пигмент можвт быль использован, например, в качесше добавки в корм для кур с целью интенсифицировання желтой окраски их кожи для интенсифицирования окраски желтков янц. Кроме того, зеаксантин можно применять в качестве кра. сителя, например, в косметической промыш. ленности.Синтез пигмейтой некоторыми микроорганиз. мами и, в частности синтезкаротиноидных пигмеи. тов бактериячи вида НачоЬастег известен, Однако промышленное производство этих пигментов путем биосинтеза представляется обычно тонким делом и достигаемые выходы малы и для получения су. ществе нных количеств пигмента приходится прибегать к очень большому количеству сред для культивирования.Изобретение относится к получению эеаксантина путем бносинтеэа простым способом с повышением выхода пигмента, Изобретение касается способа получения эеаксантина путем кулътнвиро. вания производящего этот пигмент микроорганизма вида ЕачоЬастег, при котором микроорганизм культивируют в питательной среде до полу чения клеток на стадия роста производства зеак.санпша, после чего эти клетки кульпаируют тпэн температуре 22 - 25 С в условиях достаточного на.сьпценяя кислородом в ферментацнонной питатеш ной среде, содержащей не менее 25 - 35 мг/мл уг.лерода, являющегося источником усвояемого углврода, источник ассимилнруемого аминированно 1 О го азота, содержащего свободные аминированныкислоты; содержание этих веществ поддерживают примерно в постоянном отношении, постепенно вводя их в процессе культивирования в фермен.тацнонную среду, причем культивирование про.15 должают до накопления в среде достаточного.ко.личества зеаксантнна.Микроорганизм вида Р 1 ачоЬастег представляет собой микроорганизм, избранный среди бакретнй этого вида, или мутант подобного микроорганизма, 20 Выражение "в условиях достаточного насьпцениякислородом" означает, что содержание кислорода в культиви;чуемой среде никогда на опускается ниже порогового значения, ниже которого оно становит.ся фактором, ограничивающим степень роста 2 З микроорганизмов в условиях культивирования, 575037б 10 1 б 20 Р 5 40 Условия достаточного насыщения кислородом могут быль, например, обеспечены продуванием воз.Гуха и энергичным размешиванием культивн.руемой среды. "Питательная среда" означает средукультивирования, содержащую вещества, необходимые дпя жизнедеятельности микроорганизма имиассимилируемые, Среди таких веществ можно наз.вать источники углерода, азота и минеральные соли.Однако питательная среда может содержать и иныевещества - витамины, факторы роста и микро.элементы,Согласно изобретению дйовят культурумикроорганизма вида ЕМОЬастег, которуто потоминокулируют и питательную среду, помещенную вферментер и содержащую в качестве источникаусвояемых микроорганизмами углерода и азота,Рост микроорганизмов в ферментере подпер жйваютпутем достаточного насьцения среды культиви.рования кислородом и поддержаниемнад.1 тежащей температуры -порядка 28 и 30 С и соответствующего р Н.Когда культура вступит в фазу экспоненциального роста и клетки достигнут ст дин производствазеаксантина (легко обнаруживающую, благодаряжелтой окраске этого пигмента), культивированиеклеток продолжают в условиях достаточного пасы.щения. кислородом при температуре от 22 до 25 С вводчой питательной среде, содержащей от 15 до35 мгмл хотя бы одного, углевода и источникусвояемого аминированного азота, содержащегосвободные аминокислоты, причем неизменное со.отношение соответствунлцих количеств обес.печивается последовательной добавкой обоих ве.ществ в питательную среду,Углевод, который является основным источ.ником усвояемого микроорганизмом углерода,может избираться среди таких веществ как глюкоза, лактоза и сахароза. Основным источникомусвояемого углерода может также быть смесь зтйхвеществ,Среди веществ, приемлемых в качестве компонентов основного источника аминного азота,можно указать, например, настой от вымачнваниякукурузы, экстракт дрожжей, гндролнзаты протеина, в частности продукты, полученные прикислотном или ферментативном гидролизе протеинов растительного происхождения, напримерпротеины сои или арахиса и/или гндролизат казеина("трилтон"), Этот источник аминного азота можеттакже содержать вещество, приготовленное путемкислотного или ф" рментативного гидролиза биомассы, выделенной в качестве побочного продуктабиосинтеза каротиноидного пигмента при культивировании бактерии вида Р 1 ачоЬастег, в частностипутем гидролиэа биомассы РаноЬастег, культивирсванной с целью получения зеаксантина, из кото.рой пигмеп уже выделен,Затем культивировав ", продолжают в этихусловиях в течение времени, достаточного дляполучения в культивируемой среде значительногс количества зеаксантина, содержащегося в клетках пигмента. К концу этого периода можно прекратить добавление источников углерода и азота, дав композиции культивируемой среды развиваться по мере потребления микроорганизмами питательных веществ.Во время ферментации рН культивируемой среды регулируется в пределах 6,5 8,0, предпочтитель. но между 7,0 и 7,5. Регулирование рН может быть обеспечено с памоцью щелочных растворов, например водных растворов едкого патра, едкого кали нли гищюокиси аммония или с помощью струи аммиака, пуедйочтительны два последних вещества, поскольку Они одновремент 1 о; источни. кн ассимилируемого микроорганизмами аминного азота.Затем это культивирование продолжают в те. чение времени, достаточном для образования в среде значительного количества зеаксанта. Культивирование можно продолжать и после прекращения добавления питательных веществ,Исключительно интересные результаты получе. ны при описанном выше культивировании в случае воздействия 1 . метил . 1 . нитро - 1 - нитрозогуандина (МННГ) на некоторые бактерии вида НачоЬастег по способу мутации, заключающемуся в том, что воздействие МННГ на бактерии проводят в отвержденной среде,Согласно специальной форме осуществления этого способа мупщин готовят культуру бактерии вида РачоЬестег, производящей зеаксантин.Эту культуру разбавляют в стерильном физиологическом растворе и полувоенный раствор потом смешивают в надлежащем отношении в чашке Петри с водным раствором МННГ, например с эквивалентным объемом водного раствора МННГ, содержащим 1 - 10 мг этого вещества на 1 мл, Затем в полученный раствор выливают расплавленньй агар, которьй пцательно смешивают с раствором. После затвердевания агара полученную твердую среду поддерживают при температуре инкубации 25 - 28 С до появления в среде к.олоиий, Колонии затем забирают и несколько раз подряд пересаживают на твердые питательные подложки.Мутантньй микроорганизм может стать объектом одной или нескольких последующих операций мутации в затвердевшей среде.Результаты экспериментов показали, что мутация, осуществленная в затвердевшей среде с помощью мутагенного агента позволяет получить из бактерий вида РачоЬас 1 ег мутанты, производящие в идентичных условиях культивирования зеаксантин в количестве, намного превосходящем результаты действия мутантов, полученных при обыч 1 чых способах мутации из тех же бактерий н с помош;ью того же мутагенного агента.Результаты экспериментов показали, что при культивировании мокроорганизма предлагаемьв способом производство эеаксантина намного пре.вышает выход его из культуры того же микроорганизма, но при обычно практикуемых условиях.После концентрирования бульона культуры экстрагируют из клеток эеаксантин с помощью полярного органического растворителя, например ацетона, этилового спирта или хлорированного растворителя, например хлороформа.Сепарирование биомассы из культуры можно осуществить, например, центрифутированием, декантацией или фильтрованием, Биомасса может использоваться в качестве добавки к корму для кур, или может быть подвержена экстрагированию с помощью полярного органического растворителя.П р и м е р 1. Готовят начальную культуру вида йачоЬстег (АТСС У 21588), которую пере. саживают в количестве 5 об.% в находящуюся в ферментере водную питательную среду. Питательная среда, предварительно прастерилизованная в течение 40 мин. при 120 С и потом охлажденная до 28 С, рН регулируемым с помощью аммиака в диапазоне 6,9 - 7,1 имела следующий состав,%:Глюкоза (отдельно стерилизованнаяв концентрированном растворе) 7,0Настой от вымачивания кукурузы 1,611 щролизат казеина (триптон) 0,8 Экстракт дрожжей 1,8 Сернокислый магний 0,5 Кукурузное масло 0,08 Вода водопроводная До 100 Микроорганизм культивируется в ферментерепри 28 С продуванием воздуха при энергичномразмешивании с непрерывным регулированием рНв диапазоне 7,2 - 7,3 путем систематического добавления разбавленного водного раствора аммиака,Осуществленная в таких условиях культураобладает б - 7-часовой латентной фазой, пронзвод.ство зеаксантина начинается через 14 час культивирования,Когда содержание глюкозы в ферметационнойсреде достигнет, уменьшаясь 25 кг/мл; т.е, через24 час после начала культивирования, температурусреды доводят до 24 С н в ферментер постепенновводят питательный субстрат, пред" аонтельно простерелнзованный в отдельном сосуде так, чтобысодержание глюкозы было постоянным, Состав питательного с, бстрата,%:Глюкоза 32Настой от намачивания кукурузы 4,7Гидро.".иэаг казеина (тоиптон) 4,3Экстракт дрожжей 5,5Вода водопроводная До 100рн 7,7Постепенную добавку состава продолжают втечение 20 чс., причем температура поддерживается24 С.После суммарного культивирования в течение50 час измеряют содержанием эеаксантина в культуральной среде. Для этого биомассу отделяют отпитательгто субстрата путем центриф лровання ич 5 И рн ме р 2, Культуру вида РачоЬастег (АТССИф 21081) готовят в водной питательной среде (с рН поддерживавшемся на уровне 6,5), имевшей сле.дующий состав,%:Глюкоза 3,0 40 Экстракт дрожжей 1,0Гндролизат каэеина (триптон) 1,0Сернокислый магний 0,5Г да водопроводная До 100Культуру, содержащую 5 г клеток -микроорганизмов на 1 л пнтательнои среды, разбавляют в ,отношении 1:10 по объему), путем ряда последовательных операций, в физнологическоь. стерильном растворе, содержащем 0,9 вес.% хлористо.го натрия. Затем тщательно смешивают 1 мл этого 5 10 1 б сО 25 30 зеаксантин экстрагируют иэ клеток ацетоном. раствор зеаксантина в ацетоне определяют путем колорометриче ского сопоставления с титрованными растворами синтетического зеаксантина в том же растворителе.Измеренное таким образом содержание эе. ак сантим в ферме нтационной среде составило 20 мкг/мл,Дпз. сравнения, также начальная культура выра. щнвалась общепринятым способом, С этой целью ею инокулировали 5.об,% в таком же количестве,предварительно простернлизованной и охлажденной до 28 С питательно среды рН, регулировавшемся в пределах 6,9 - 7,1, Композиция имела следующий состав,%: Глюкоза 10,0 Настой от вымачиваниА кукурузы 1,85 Гндролизат казенна (трн,точ) 1,25 экстракт дрожжей 2,1 Сернокисльш магний 0,5 Кукурузное масло 0,08 Вода водопроводная До 1000Кульпвирование проводилось с размешива. нием нрн энергичном продувании воздуха с непрерывным регулированием рН до уровня 7,2 - 7,3. Длительность латентной фазы 8 час, Получение эеаксантина начиналось через 15 час. Температура среды поддерживалась спустя 24 час с начала культивирования на уровне 24 С, Через 55 час после начала культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде определенное вышеука. занным образ м) равнялась 12 мкг/мл,раствора с 1 мл водного раствора МННГ, содержащего 5 мг/мл этого вещества в чашке Петри. Потом на нриготовленный таким образом раствор. выливают 10 мл аара н производяттщательноесме. шивание агара с раствором. После затвердения агара ча гку Петри ннкубнруют прн температуре порядка 25-28 С до появления в отвержденной среде колоний, т,е. через двое. четверо суток, Затем колови отбирают иэ чашки Петри и помещают 1 путем ряда последовательных операций) на питательные агаровые подложки в отсутствии МННГ.Полученный мутант потом инокулнруют в количестве 5 об,% в 100 мл стерильной питательной среды РН, поддерживаемым на уровне 6,5, имеющей следующий состав,%:Глюкоза 3,0 Экстракт дрожжей 1,0 1 идролизат казевщ (триптон) 1,0 Сврнокислый магний 1,0 Вода водопроводная До 100Микроорганизм культивируют в этой среде при 28 С в аэробиых условиях в течение 24 час, потом эта культура Вновь переносится В 2 л нитательиой среды такого жв состава. Спустя 24 час фермен. тации, осуществленной в тех же условиях, культура переносится 5 Об.% в находящуюся в ферментере питательную среду. Питательная среда, предвари. тельно простерилизованная в течение 40 мин приоС и охлажденная до 20 о С рЯ регулифи 4 ым аммиаком иа уровне 6,9 - 7,1, имеет следуницифсоставу%:Глюкоза (предварительно простерилизованная в концентрированномрастворе) 7,0 Настой от вымачивани кукурузы 1,0 1 Ъдролнзат казеина (триптон) 0,8 Экстракт дрожяюй 1,8 Сернокислый магний 0,5 Кукурузное масло 0,08 Воца водопроводная До 100Культивирование производят в ферментере при 28 С с аэрнрованнем, энергичным размешиваиием и автоматическим регулированием. рН среды на уровне 7,2-7,3, Длительность латентной фазы 5 - 6 час, образование зеакса)пина начинается через 12 час после начала культивирования,Когда содержание глюкозы в этой культуре достигнет, уменьшаясь, 25 кг/мл, т.е. через 22 час после начала культивирования температуру среды доводят до 24 С, и в нее с таким расчетом, чтобы сохранить примерно постоянный уровень содержания глюкозы, вводят предварительно простерилизованный питательный субстрат, рН которого регулируется на уровне 7,2, имеющий следующий со.стев,%:Глюкоза 32 Настой от намачивания кукурузы 4,7 Гидролнзат казеина (триптон) 4,3 Экстракт дрожжей 4,5 Вода водопроводная До 100Состав вводят постепенно в течение 20 час, причем температуру среды поддерживают на уровне 24 С. После суммарного культивирования в тече. ние 48 час концентрация глюкозы в среде достигает 6 мг/мл, а содержание эеаксантина, измеренное описанным в примере 1 способом, составляет335 мкг/м .П р н м е р 3, Описанным в примере 2 образом готовят мутант ЕачоЬас 1 ег (АТСС 21081).5 10 Мутант инокулируют в 4 об,% в водную, предварительно простернлизованную в течение 40 мин при 120 С, питательную среду и охлажденную до 28 С и помещают в ферментер. Эта питательная среда с рН регулируемым с помощью аммиака, в пределах 6,9 - 7,1 имеет следующий состав,%: Глюкоза 7,8 Настой от вымачнвания кукурузы 1,8 Вццюлизат жмыха 0,7 Экстракт дрожжей 2,0 Сернокислый магний 0,5 Кукурузное масло 0,08 Вора водопроводная До 100 И 11 икроорганйзм культивируют в ферментатбрвнри 28" С, как Описано в примере 2.После того, как содержание глюкозЫ в средедостигнет 25 мг/мл, температуру среды доводят ро24 С и в нее постепенно чтобы обеспечить при.0 мерно постоянный уровень содержания глюкозы,предварительно простерилизованный питательный субстрат, с рН регулируемым на уровне7,2% следующего состава,%:Глюкоза 12чб Настой от вымачивания кукурузы 4,7Гидоолизат жмыха арахиса 3,5Экстракт дрожжей 6,0Вода водопроводная До 100Добавку Осуществлять в течение 20 час приЗО температуре 24 С,Спустя 51 час общего культивирования, содержание глюкозы в среде доходит до 7,5 мг/мл.Содержание зеаксантина, определенное по описан.ному в примере 1 способу, равняется 312 мкг/мл.П р и м е р 4, Приготовленную культурубактерии Е 1 ачоЬастепця аццат 11 е (АТСС У 11974)инокулируют в находящуюся в ферментере питательную среду. Это предварительно простерилизо.ванная в течение 40 мин при температуре 120" Сф40 охлажденная до 28 С водная питательная среда, рйкоторой поддерживается аммиаком на уровне6,9 - 7,1, идентичная питательной среде, описанной впримере 1,Культивируемый в ферментере в тех же услови.ях температуры рН и продувания воздуха, как впримере 1, микроорганизм обладает 6 - 7-часовойлатентной фазой и начинает производить зеаксантинчерез 14 час от начала культивирования.Когда содержание глюкозыв ферментационной60 среде достигнет, постепенно уменьшаясь, 25 мг/мл,т,е, спустя 24 час после начала культивированиятемпературу устанавливают на уровне 24 С н вферментер вводят, предварительно простерилизованный в отдельном сосуде питательный субстрат с рН,55 регулируемым на уровне 7,2, Состав субстратааналогичен составу субстрата, описанному в при.мере 1, Субстрат вводится в ферментер с расчетомна сохранение постоянного уровня содержания глю.козы в среде (25 мг/мл) в течение 20 час, Тем 60 пература среды поддерживается на 24 С,575037 10 Составитель М, ДраншиниковТехред А. Демьянова Корректор П. Макаревич Редактор д. Герасимова Заказ 2779/699 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открчтий 11035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ГПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Спустя 50 час суммарного культивирования содержание зеаксантина в ферментационной среде определяют хромагрифированием в тонком слое и ультрафиолетовой спектроскопией.Содержание зеаксантина в ферментационной среде при таких методах измерения 1 б мкг/мл.Для сравнения бактерия культивировалась обычным образом (списанным, также для сравнения в примере 1), Через 55 час от начала культивирования содержание зеаксантина в ферменгацнонной среде оказалось равным только 4 ьпсг/мл.П р и м е р 5. Приготовлен по описанному в примере 2 способу и при тех же самых условиях ВачоЬастег 1 ое адоа 111 е (АТСС Иа 11947).Мутант кульпщировался затем в тех же питательных средах, с постепенным добавлением того же питательного субстрата, как в примере 2, причем в тех же условиях,Спустя 48 чвс суюариого культивирования концентрация глюкозы достигла 5 мкг/мл, а со. держание зеаксантнна в среде, измеренное аналогично описанному в примере 4, равно 40 мг/мл,Формула изобретения 1. Способ получения зеаксаитина вутем культи. вирования микроорганизма рода ВаиоЬвстег как продуцента этого пигмента, отличающий ся тем, что, с целью получения пигмента в чистом виде, этот микроорганизм культивируют на питательной среде до стадии роста клеток и образования эеаксантнна, после чего клетки этой культуры выдерживают при температуре 22 - 25 С вазробных усло.виях в жидкой питательной среде, содержащей неменее 25 - 35 мг/мл углевода к к источника усвоя 5 емого углерода н по меньшей мере один источникусвояемого амннного азота, содержащий свободныеаминокислоты, приткм соответствующие коли.честна этих веществ поддерживают в постоянномсоотношении путем постеленного добавления этих1 О веществ в культуралъную среду, и продолжаюткультивирование до образования в соеде достаточ.ного количества межклеточного зеаксантина,2, Способ но н. 1, о т л и ч а ю.щ и й с я тем, чтокультнвиро.ание нродуцента ведут в средеи рН 6,5 - 8,0,3. Способ по и. 1, о т л н ч а ю щ и й с я тем, чтов качестве утлевода берут глюкозу, лактоэу нлисаха розу.4, Сиособ ло п, 1, о т. и ч а ю щ и й с я тем, чтоИ источник аьжнногв азота содержит экстракткукурузы.5, Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоуглевод и источник аминцогс азота добавляют вкультуральную среду в весовом соотношении25 1,6:3,4 соответственно. 6, Способ но н. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что клетки с зеаксавтнном выделяют из культуральной среды путем сепарирования,З 0 7, Способ по и, 1 - 6, о т л и ч а ю щ н й с я тем,что зеаксаитин выделяют из клеток путем экстра. гнрования полярным растворителем.