Способ получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков

(51) ЕНИЯ титут тонкой хи им, М.В.Ломоно.8)етельстВ 37/12ш С,М,1, Иг а, 1978 во СССР1980. Вегце 1- в К.14,А,ч. 513,ков, что достига связыванием поли жащей матрицы с пидом в присутст лярном соотнощен хлорида алюминия 1,5-2 ч. 2 табл. ся валент ой ари сахари содер ным иенасии А 1 1 и олипида в течен моии о:В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОПИСАНИЕ ИЗ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Московский инмической технологисова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТОВ ДЛЯВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПИД-ЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ(57) Изобретение относится к химииполимеров и может быть использованов хроматографической технике для выделения липид-зависимых белков,Изобретение позволяет простым и удобнымспособом за 1,5-2 ч получить сорбенты для выделения липид-зависимых бел 1409319Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к способу получения сорбентов длявыделения липид-зависимых белков, и5может быть использовано в биотехнологии и хроматографической технике,Цель изобретенияупрощение технологии способа.П р и м е р 1. Получение сорбента с использованием яичного фосфатидилхолинв, 2 мл водно-этанольногогеля фенил-сефароэы С 1-4 В обезвожиают промывкой ацетоном и переводятв .ухой дихлорэтан (10 мл). Добавляют 0,12 ммоль природного фосфатидилхолина в 1 мл сухого дихлорэтана.Смесь перемешивают и инкубируют1,5 ч, после чего добавляют 060 ммольбезводного хлористого алюминия, Катализатор прибавляют небольшими порциями при перемешиваншРеакцию проводят 1,5 ч при 18-20 С и интенсивном перемешивании, особенно первые5-10 мин. Реакционную колбу защищают 25от света, По истечении указанного времени к реакционной массе добавляютО мл водного ацетона, Смесь переносят на фильтр и промывают 30 мл водного ацетона для удаления катализатора, затем 20 мл ацетона, 30 мл хлороформа для удаления избытка фосфолипида, 10 мл ацетона, 50 мл 0257-ноготритона Хдля удаления неспецифически связанного с сорбентом фосфо 35липида, в для удаления детергентапромывают водой, Полученный сорбентанализируют на фосфор, Степень связывания яичного фосфатидилхолина сполимером составляет 1,3-1,8 мкмоль 40лиганда/мл геля, Скорость протеканияполученного сорбента по сравнению сисходной фенил-сефароэой не изменяется, для колонок 0,5 х 2,0 см составляет 12-15 мл/ч,45 Данные по примерам 2-20, контрольным примерам 21-23 и сравнительному примеру 24 приведены в табл,1,П р и м е р 25. Выделение фосфолипвзы А яда осы, Навеску (4 мг) лиофилиэированного яда осы растворяют в 1 мл 005 М трис-НС 1 буфера, рН 7,5, содержящего 0,01 М и 0,2 МИаС 1(буфер 1), и наносят на колонку 70 х х 0,55 мм с 2 мл полученного сорбента, содержащего 1,8 мкмоль липидного фосфора/мл геля, уравновешенного тем же буфером 1, Белок инкубируют с сорбентом 4 ч при 4 С, Баластныебелки удаляют промыванием колонки буфером 1 (30 мл). Фермент злюируют с колонки в отсутствие ионов Са буфером 11 (0,05 М трис-НС 1, рН 7,5, 0,05 М ЭДТА 0,02 М ИаС 1), содержащим 0,0 Ж тритона Х(19 мл), При последующем увеличении содержания тритона Хдо 017. в буфере для злюирования не наблюдают выхода с колонки белка и фосфолипаэной активности,Скорость элюирования 12-15 мл/ч, температура 4 С.Фосфолипаэную активность измеряют методом потенциометрического титрования при постоянном рН, В качестве субстрата используют яичный лецитин, Реакцию проводят в термостатированной ячейке РН-стата при 37 С и рН 7,5. Реакционная смесь состоит иэ 2 мл 0,01 М тритона Х, содержащего 0,01 М СаС 1 , и 0,05-0,1 мл 005 М этанольного раствора субстрата. Добавляя к реакционной смеси 0,05 0,1 мл ферментного раствора, регистрируют объем титранта (0,0 М БаОН) прошедшего на поддержание постоянного рН в первые 10-15 с.Белок контролируют спектрофотометрически по поглощению при 280 нм и по методу Лоури. Результаты по очистке фосфолипазы А из ядов осы и большого шершня приведены в табл.2.Формула изобретенияСпособ получения сорбентов для выделения липид-зависимых белков путем ковалентного связывания полисахаридной матрицы с ненасыщенным фосфолипидом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения технологии, суспенэию арилсодержащего сшитого полимера обрабатывают раствором фосфолипида, затем избытком хлоридв алюминия в течение 1,5-2,0 ч при мо" лярном соотношении фосфолипида и хлорида алюминия 1:5-6,409319 Условия полУчения сорбектовф) Тю фосфолипид оляр оотн епень свяэыяання,моль лигандв/кл геля личес фосфо йкие Средне чення опытов с л фатидилх яичный,4 7,1:5 1 Фосфв тадао 55-6,4 5 ф 95 ф О,0,95 0,3 2 ве аЮ 10,0-13,01,50 т 1 фОО 0 1:5 2,51,2-1,4 1,30 т 60 В прина ра иэ иоэгаго рогатскота 1,0 0,3-0,15 1,2-1,Таблица1,550,250,45+ 0) 05 1,052 0,00,60+ О, 01409319 Продолжение табл.1 Количест во хлори Молярн ень сэязыяания,ль лиганда/мл геля ре мяеах Тип фосфолипид Количестэо фосфолипида,соотнош ние фос фолилид и да ало нера Ание Средне чения опытов-24 приведены ч в е лътаты в примерахолииера;уаение гелевой сера используетс качестве лиганда - окислприведено суммрное времясостоящего нэ стадий: онихолина - 2 ч, связываниеблокирование неврореагиро2 ч,лица Емкость,мг/мл Белок мгСтепен сходные яды,рак ции тивность кодЕ ист Уде б ная,ед м 0 ходный яд ось,24 36 ходный яд большшершня Извест ный 6480 2,08 3912 2 оставитель Л,Чуповаехред Л. Сердюков ва Корректор Л.Пилипенко едактор И.Касарда Тираж 5 ПодписиСССР Заказ 3420 ВНИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Роушская наб город, ул. Прое оизводственно-полиграфическое предприятие,Предлагае"мый ракция фосфолипа ы А после биос ифической хрома- ографии Фракция фосфолипазы Аа после биоспе цйфической хрома- тографии иный проб слани фосфо рук туры полимера;АН-сефароза 4 В, вичный фосфатидилхолин,са иммобилизации,яичного фосфатидиллилида с полюеером - 24аииногрупп полииера