Способ получения белкового гидролизата

(9) ( ) 5)5 С 12 й 1/ ИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКО В ИДЕТЕЛ ЬСТВУ 0 полноценми и микрозлею отдельных ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГГИДРОЛИЗАТА(57) Иэобретенибиохимическихприменение в е относится к производствпрепаратов .и может найтимикробиологической про Изобретение относится к производству биохимических препаратов и может найти применение в микробиологической промышленности, а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств.Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота,Способ осуществляется следующим образом,В качестве исходного сырья используют отходы - фарш свиных почек после выделения аминоацилазы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95 С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8.0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют мышленности, а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств. Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата эа счет обеспечения высокого содержания аминного азота. Способа заключается в том, что в качестве исходного сырья используют отходы - фарш свиных почек после выделения аминоацилазы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95 С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют при рН 4,7-5,5. 4 табл. при рН 4,7-5,5 и постоянное значение рН в процессе гидролизата поддерживают карбонатом или бикарбонатом натрия.Термообработка почечного фарша при 85-95 С в течение 10-20 мин способствует денатурации белка, что приводит к повышению чувствительности к протеолитическим ферментам.Однако при длительном нагреве или нагреве при более высоких температурах устойчивость белков к ферментам либо не меняется, либо повышается, Оптимальной является термообработка при 85-95 С в течение 10-20 мин. Предварительная термообработка обеспечиваеттакжедополнительную защиту от роста посторонней микрофлоры в процессе гидролиза.Почки содержат около 1ных белков, богаты витаминаментами. По содержани10 15 20 25 30 витаминов и микроэлементов почки превосходят говядину. Применение в качестве исходного сырья почечного фарша позволяет получить гидролизат, содержащий ростовые вещества, неорганические соединения фосфора, калия, магния, железа, а также микроэлементы: медь, марганец, молибден,Ведение процесса гидролиза панкреатином при непрерывном перемешивании (массообмена при ферментативном гидро- лизе имеет большое значение) и рН 7,4-8,0 Интенсифицирует процесс и повышает качество гидролизата, так как увеличивает количество свободных аминокислот. Гидролиэат содержит 65-80 свободных аминокислот 16 наименований, среди них незаменимые аминокислоты: аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин,метионин, треонин, фенилаланин. Отделение негидролизованного белка при рН 4,7-5,8 предохраняет От выпадания в осадок фосфорсодержащих соединений, некоторых катионов.Данные изменения показателей качества гидролизата в зависимости от рН приведены в табл, 1,При более низком значении рН увеличивается зольность получаемого препарата, при повышении рН уменьшается доля свободных аминокислот. В интервале рН 4,7- 5,5 при нагревании быстро происходит коагуляция негидролиэованного белка, а также уменьшаются затраты времени на фильтрование. П р и м е р 1. В стеклянный реактор срубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 85 С.Включив мешалку, загружают в реактор 6 кг почечного фарша, отходы после выделения аминоацилазы. Температуру смеси доводят до 85 С и выдерживают при данной температуре в течение 10 мин, Затем температуру в реакторе снижают до 38-42 С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспенэии в количестве 120 г. Через 30 мин, а затем через 1 ч проверяют реакцию смеси и при необходимости подщелачивают до рН 7,4, Добавляют в реактор 150 мл хлороформа. Гидролиз ведут при рН 7,4 при постоянном перемешивании при 38-42 ОС в течение 24 ч. По окончании гидролиза смесь подкисляют добавлением кислоты до рН 4,7, температуру в реакторе поднимают до 90 С и,выключив мешалку, выдерживают смесь при указанной температуре в течение 0,5-1,0 ч, Полученный гидролиэат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяет содержание аминного азота, равное 710 мгф. 35 40 45 50 55 П р и м е р 2. В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 88 С, Включив мешалку, загружают 6 кг почечного фарша, отходы после выделения аминоацилазы, Температуру смеси поднимают до 88 С и выдерживают при данной температуре в течение 15 мин. Смесь охлаждают до 38-42 С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспензии в количестве 120 г, Через 30 мин после добавления фермента проверяют реакцию смеси и подщелачивают до рН 8,0. Через 1 ч проводят повторную корректировку рН, В реактор вводят 150 мл хлороформа и ведут гидролиз при непрерывном перемешивании при рН 7,8 и 38-42 С в течение 24 ч. Содержимое реактора подкисляют до рН 5,2, температуру в реакторе доводят до 90 С и, выключив мешалку, выдерживают смесь при данной температуре в течение 0,5-1.0 ч. Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр, В фильтрате определяют содержание аминного азота, равное 690 мг 7 ь.П р и м е р 3, В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 95 С. Включив мешалку, загружают 6 кг почечного фарша. Температуру смеси поднимают до 95 С и выдерживают приданной температуре в течение 20 мин. Смесь охлаждают до 38-42 С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспензии в количестве 120 г. Через 30 мин после добавления фермента проверяют реакцию смеси и подщелачивают до рН 8,0. Через 1 ч проводят повторную корректировку рН. В реактор вводят 150 мл хлороформа и ведут гидролиэ при непрерывном перемешивании при рН 8,0 и 38-42 С в течение 24 ч. Затем содержимое реактора подкисляют кислотой до рН 5,5, температуру в реакторе доводят до 90 С и, выключив мешалку, выдерживают смесь при данной температуре в течение 0,5-1,0 ч. Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержание аминного азота, равное 680 мг=,ь.П р и м е р 4. Отмеряют 1 л дистиллированной воды, 13 г агара Заливают 200 мл дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания, В колбу вносят 14 г панкреатического почечного гидролиэата 5,0 г хлорида натрия, 1,0 г глюкозы и растворяют в 800 мл дистиллированной воды при нагревании, прибавляют замоченный агар. раствор нагревают до полного его расплавления. устанавливают рН 7,5 .ф.0,2. При не1 б 93042 10 15 20 30 35 40 50 55 обходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают в пробирки по 4 мл и в колбы по 150 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром поддавлением при 121 С в течение 15 мин.Испытание ростовых свойств среды проводят с помощью контрольного штамма ВасПоз сегеоз АТСС 10702 и другими аэробными микроорганизмами. 1 мл суточной культуры ВасПиз сегеоз АТСС 10702(или другого аэробного микроорганизма) вносят в 100 мл стерильного 0,9 ь-ного иэотонического раствора хлорида натрия. По стандарту мутности для оптической стандартизэции бактерийных взвесей определяют мутность полученной взвеси и соответствующую концентрацию бактерий тест-штамма. Затем готовят разведения, по 1 мл каждого раствора вносят в чашку Петри со средой и распределяют шпателем по поверхности, Инкубируют в термостате не менее 48 ч при 38 С, хотя для получения достоверных данных по ростовым свойствам среды достаточно и 24-часового инкубирования. Результаты оценки роста тест-штамм ВасПцз сегеоз АТСС 10702 и других аэробных микроорганизмов после 24 ч инкубирования представлены в табл, 2,Количественное определение общего числа бактерий с помощью предлагаемой среды и среды на мясопептонном агаре проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром 90-100 мм, Образец лекарственного средства в количестве 10 г растворяют или суспендируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем раствора был 100 мл. Приготовленный раствор образца вносят по 1 мл в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до 45-50 С среды, Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды, Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой 45 агэра. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при 30-35 С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число бактерий в 1 г образца.П р и м е р 5. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 13 г панкреатического почечного гидролизата, 7,5 г натрия фосфата двузамещенного, 2,5 г калия фосфата однозамещенного, 10 г глюкозы, прибавляют 8 мл.1-ного раствора фенолового красного ( 008 г) и 3 мл 0,5-ного раствора малахитового зеленого (0,015 г), Устанавливают рН 7,50,2 и кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, Стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121 С в течение 15 мин в паровом стерилизаторе,Ростовые свойства предлагаемой среды определяют с помощью тест-штамма ЕзсЬегсЫа сой АТСС 25922, ЯагпопеПа турЫ,1 мл суточной культуры ЕзсЬегсЫа соП или ЯагпопеПа сурЫ вносят в 100 мл стерильного 0,9-ного изотонического раствора хлорида натрия. По стандарту мутности длябактерийных взвесей определяют мутность полученной взвеси и соответствующую концентрацию бактерий тест-штамма, Затем готовят разведение, по 1 мл каждого раствора вносят в колбу со 100 мл питательной среды и инкубируют в термостате при температуре 30-35 С в течение 24-48 ч,Результаты приведены в табл, 3,Предлагаемую питательную среду испытывают при контроле на микробиологическую чистоту нестерильных лекарственныхсредств для выявления бактерий семействаЕп 1 егоЬассепасеа 1. Испытания проводят последующей методике: образец лекарственного средства в количестве 10 г вносят в 100мл питательной среды, перемешивают и инкубируют при 30-35 С в течение 24-48 ч.Наличие роста определяют по помутнениюсреды, а также газообразованию. Для сравнения используют среду на мясопептонномбульоне по прототипу.Данные по выявлению бактерий семейства ЕпегоЬасепасеае в лекарственныхпрепаратах и вспомогательном сырье приведены в табл, 4.Как видно, предлагаемая питательнаясреда позволяет проводить выявление бак-,терий семейства ЕпегоЬастепасеае на уровне среды на мясопептонном бульоне,Полученный гидролиэат используется для приготовления питательных сред, которые применяются в микробиологической промышленности и в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств, в частности при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств и вспомогательного сырья на средах с разными источниками азотного питания.Формула изобретения Способ получения белкового гидроли-. зата включающий гидролиз исходного сырья панкреатином, инактивацию фермента, отделение балластных белков и осветление целевого продукта, о тл и ч а ю щ и й с я1693042 тем, что, с целью повышения качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота, в качестве исходного сырья используют почечный фарш после водной экстракции аминоацилазы, причем исходный материал перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95 С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балласт ные белки от гидролизата отделяют при рН4,7-5,5. Таблица 1 а блиц та на питательнои среде на основе панкреатического и чечного гидролизата 14 г/л эра ктеристи ас 1 Оз цН 111 з Рзсобоаопаз аегод 1- поза ас 1 Ъ егеоз Ьег 1 сиасо 1 а воЬе 1 а турЫ+ т роста та та П р и м е ч а н и е.-сплошной, обильный рост тест-культуры; - хороший рост, массалившихся колоний; - умеренный рост;+ - отдельные колонии и накопление колоний, т,е.меется рост микроорганизмов. Количество клеток в 1 мл 0,9-ного растворайаС 8,510 8,510 8,5 10 8,5 10 8,5 10 8,5 10 8,5 1085.11 б 93042 10 Таблица 3 Питательная среда на основе почечного панкреатического гидолизата и и кон ент а иях гид олизата, г(лПитательная среда на основе мясопептонного бульона 14 10 18 15+нП р и м е ч а н и е,- сильное помутнение и газообразование;-умеренное помутнение и газообрэзование; + - помутнение (во всех случаях изменения цвета среды с красно-коричневого на оранжевый). Табл и ца 4 Выявление бактерий семейства ЕптегоЬасгегасеог в 10 г с бст атаПроба Количество проб Среда на мясной во е и пептонеСреда на белковом гид олизате Ортофен (таблетки) Ибупрафен (таблетки) Зтацизин (таблетки) Этмозин таблетки) Пиперазин-адипинат (порошок) Мука пшеничная Стеарат кальция Тальк Крахмал картофельныйСоставитель Г.ЗолотареваРедактор О.Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец Заказ 4051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж,. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Количество клеток в 1 мг 0,9%-ного растворайаС 8,5 10 8,5 10 8,5 10 8,510 8,510 8,5 10 85 1085 8,5+ + +н+ + ++н+. + + + 3 3 2 1 1 4 2 2 2+ Нет роста 0;0;0 0;0;0 0;0 0 0 О+ О+