Способ выделения реснитчатых клеток животных

)5 С 12 85/О ОСУДАРСТВЕННЫЙО ИЗОБРЕТЕНИЯМРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯ НИЕ ИЗОЬРЕТЕН ОП ВИДЕТЕЛЬСТ АВТОРСКО(71) Тихоокеанский океанологический институт Дальневосточного отделения АН СССР(56) М га(агпА.,з ) а(а Я, Тгйоогорегапе, Яапб ччбо по( п)ЬИ йе саШ(п берепбепт аггея гезропзе оотгтоп - ех(гастеб атега са оп е д о 1 Му(з - ).Гас.Яс.Опа. Тосуо, 1985, ч,16, М 1, рр, 59 - 65.Мораска Л., Эрба Э. Проточная цитометрия, - В кн.: Культура животных клеток, Методы, М.: Мир, 1989, с, 182 - 213,Изобретение относится к биотехнологии, направлено на препаративное получение изолированных реснитчатых клеток,може быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине пртестировании цитотоксичности факторосреды и химических соединений.Целью изобретения является повышение чистоты выделения клеток.Способ осуществляют следующим абра зом,Извлекают ткани из животного, промывают ее, обрабатывают ткани в растворе дезагрегирующих веществ, активизирующих движение клеточных ресничек, удаляют остатки ткани из полученной клеточной суспензии и осаждают реснитчатые клетки. В качестве дезагрегирующих веществ используют соединения, активизирующие движение клеточных ресничек, Для повышения(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕСНИТЧАТЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине, Цель изобретения - повышение чистоты выделения реснитчатых клеток. После извлечения и промывки ткани животного ее обрабатывают соединением, активизирующим движение клеточных ресничек, Затем остатки ткани удаляют, а реснитчатые клетки осаждают. 1 з,п.ф-лы,выхода реснитчатых клеток используют серотонин в концентрации 5.10 М.Дезагрегация ткани, содержащей реснитчатые клетки, происходит за счет избирательного отделения реснитчатых клеток в результате увеличения частоты биений ресничек реснитчатых клеток. Увеличение частоты биений клеточных ресничек достигается обработкой ткани раствором веществ, увеличивающих частоту биений ресничек. Повышение частоты биений ресничек, находящихся в эпителии клеток, увеличивает гидродинамические силы сдвига между отдельной клеткой с бьющимися ресничками и соседними нереснитчатыми клетками, Из-за увеличения сил сдвига относительно нормы повышается вероятность отрыва от эпителиального слоя тех клеток, у которых увеличена интенсивность движения ресничек. В результате отдельные физи 1684336Препаративное выделение реснитчатых жаберных клеток моллюсков показало, что 90 - 95 клеток полученной суспензии имели бьющиеся реснички, Следовательно, заявляемый способ обеспечивает избирательность выделения и одновременно высокий выход физиологически активных 55 ологически активные реснитчатые клетки вырываются из окружающих их нереснитчатых эпителиальных клеток и переходят в суспензию. Поскольку каждая реснитчатая клетка отрывается от клеточного слоя от дельно от других клеток, в суспензию не попадают клеточные агрегаты, а только отдельные клетки. Поэтому способ приводит к получению одноклеточной суспензии. Реснитчатые клетки со сниженной физиологи ческой активностью не способны увеличить частоту биений ресничек. Поэтому эти мэлоактивные клетки не развивают достаточных сил для того, чтобы отделиться от клеточного слоя. Следовательно, отделяются от тка ни и переходят в клеточную суспензию толькО физиологически активные реснитчатые клетки; Выделенные реснитчатые клетки сохраняют свою нативностьпоскольку имеют на своей поверхности бьющиеся ре снички.Эксперименты, проведенные с реснитчатыми клетками двустворчатых моллюсков, свидетельствуют, что частота биений ресницек лэтерэльных жаберных клеток в 25 покое составляет 10 Гц, а при обработке жабр серотонином частота биений повышалась до 27 Гц, допамином - до 19 Гц. Перфузия жабр двустворчатых моллюсков раствором серотонина с концентрацией от 30 1 х 10 до 1 х 10 М приводи к дозозависимому увеличению частоты биений ресничек латеральных клеток. Частота биений этих ресничек в 1 х 10 М растворе серотонина увеличивается до 20 Гц, в 1 х 10 М растворе 35 до 22 Гц, в 1 х 10 М растворе до 23 Гц, в 1 х 10 М растворе до 25 - 26 Гц. Сходное увеличение активности ресничек вызывают растворы теофиллина, каффеина и изобутилметилксантина, Смеси нескольких веществ могут значительно повышать частоту 40 биений лэтеральных жаберных ресничек.например растворы; 1 мМ теофиллина + . 0,005% сапонинэ: 1 мМ теофиллина+ 0,05 О сапонина + 0,1 мМ цАМФ (до 25 Гц); 1 мМ теофиллина + 0,01 ф сапонина + 0,01 мМ 45 цАМФ (до 22 Гц). Все перечисленные вещества и смеси веществ, увеличивающие частоту биений клеточных ресничек, могут быть использованы в предлагаемом способе в качестве дезагрегирующих веществ, 50 нативных реснитчатых клеток, т,е. повышает чистоту выделения реснитчатых клеток.П р и м е р, Жабры двустворчатого моллюска (приморский гребешок) извлекали,промывали фильтрованной морской водойи обрабатывали растворами серотонинкреатининсульфата в фильтрованной морскойводе нормального состава в течение 2 ч прикомнатной температуре. Были использованы растворы серотонинкреатининсульфата5 концентраций: 1 Х 10.7 М; 5 Х 10.7 М; 1 Х 10.6М; 5 х 10 М; 1 х 10 М. Соотношение ткань:дезагрегирующий раствор было 1:10 по объему. Из полученной суспензии реснитчатыхклеток затем удаляли ткань и центрифугированием в течение 5 мин при 10009 осаждалиреснитчатые клетки.Реснитчатые клетки составляли 90 -95 О от всех клеток полученной суспензииво всех случаях, Клетки были физиологически активными, поСкольку их реснички двигались. В случае применения растворовсеротонинкреатининсульфата выход реснитчатых клеток составлял: 1 х 10М - 3 -4,5 млн клеток /1 г влажной ткани; 5 х 10 Ми выше - 5 - 6 млн клеток/1 г влажной ткани,При использовании растворов серотонинкреэтиниксульфата выше 5 х 10 М в полученной суспензии дозозависимым образомувеличилось содержание изолированныхресничек, обламывающихся с поверхностиреснитчатых клеток в результате значительного увеличения частоты их биений.Следовательно, использование в качестве дезагрегирующего вещества растворасеротонинэ с концентрацией 5 х 10 М необходимо и достаточно для оптимального осуществления заявляемого способа.Также могут быть выделены реснитчатые клетки с использованием растворов теофиллина и каффеина. а также смесинескольких веществ того же ряда,Ф о рмул а и зоб рете н ия1, Способ выделения реснитчатых клеток животных, предусматривающий извлечение ткани из животного, промывку ее,обработку ткани дезагрегирующим веществом, удаление остатков ткани из полученнойтаким образом клеточной суспензии, осэждение взвешенных клеток, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения чистотывыделения реснитчатых клеток, в качестведезагрегирующих веществ используют соединения, активизирующие движение клеточных ресничек,2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что в качестве дезагрегирующего вещества используют раствор серотонина в концентрации 5.10 М.