Способ определения электронно-донорной активности химических соединений

(54) СПО ДОНОРНОЙ ДИНЕНИИ (57) Изо зике и б повышени В контрол ныи и опытный обра вводя ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ(71) Институт биологАН СССР(56) Авторское свидетельс1( 1143193, кл. С 01 М 33/ Б ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЛЕКТРОННОКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕретение относится к биофиохимии. Цель изобретения чувствительности способа. гемсодержащее соединение, освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптическойплотности в полосе поглощения гемсодержащего соединения, Электроннодонорную активность тестируемогосоединения определяют по увеличениюскорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнениюс контрольным, Выбор в качестве тестсоединения гемсодержащих соединенийопределяется высоким значением ихкоэффициента экстинкции, а также удовлетворительным разнесением полоспоглощения восстановленнойи окисленной форм этих соединений. 2 з.п, ф-лы, Я1 табл.,и биофизике и может быть использовано в фармакологии для первичной оцен-ки биологической активности химических соединений на стадии предбиологических испытаний,. Целью изобретения является повышение чувствительности способа засчет введения в образцы гемсодержащего соединения,Способ осуществляют следующим образом.В контрольный и опытные образцы вводят гемсодержащее соединение, которое, являлясь акцептором электронов,изменяющий свой цвет при восстановлении, служит удобным тест-соединением для определения электроннодонорной активности химических соединений. Затем опытный и контрольный образцы освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе поглощения гемсодержащего соединения, Электронно -донорную активность тес,тируемого соединения определяют по увеличению скорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным.При этом для определения электронно-донорной активности водорастворяемых соединений в качестве гемсодержащего соединенйя используют гемсодержащий блок, а для водонерастворимых соединений - геминВыбор в качестве тест-соединения именно гемсодержащих соединений определяется высоким значением их коэффициента экстинкции, составляюшим 1-1,5 10 М см ", а также удовлетворительным (около 20 нм) разнесением полос поглощения восстановленной и окисленной формы этих соединений, что в совокупности и обеспечивает высокую чувствителъность предлагаемого способа. П р и м е р 1. Определение электронно-донорной активности блокаторов кальциевых каналов у риосидила,верпамила, дилтиазема (все соединения водорастворимы) по .восстановлению миоглобина,Опытный образец, представляющийсобой водный раствор объемом 2 мл,содержащий 110М красителя эозина, 1 10 М миоглобина и 1 10 М ри осидила, поместили в герметизированную оптическую кювету и удалили со 5 10 15 20 25 30 35 40 держащийся в растворе кислород путемосторожной откачки на форвакуумномнасосе (до 10 торр) в течение 30 мин.Деаэрированный образец поместили втермостатированное кюветное отделение спектрофотометра Сф(можнотакже использовать Сфили "Спекорд")и записали исходный спектр поглощения опытного образца. Затем этотобразец освещали светом лампы накаливания (100 Вт), пропущенным черезсветофильтр ЖС( М э 500 нм), и записывали спектр поглощения образцачерез 1,2,3,4,5 и 6 мин освещения.Освещение опытного образца приводит к изменению спектра поглощенияакцептора электронов-миоглобина. Приэтом исходная полоса поглощения окисленного миоглобина уменьшается и возрастает более длинноволновая полоса,соответствующая восстановленной форме миоглобина.По приращению поглощения длинноволновой полосы за время освещенияопытного образца в течение 1,2,3 и4 мин строили кинетическую кривую фотовосстановления миоглобина в присутствии риосидила.Такие же операции проводили и сконтрольным образцом, не содержащимриосидила и строили кинетическую кривую восстановления миоглобина в контрольном образце,Аналогично тестировали верапамил(содержание его в опытном образце1 10 М) и дилтиазем (содержание вопытном образце 1 104 М) и строиликривые восстановления миоглобина вих отсутствии,За 1-ю мин освещения контрольного и опытного (с риосидилом) образцов миоглобин в присутствии риосидила восстанавливается почти в 6 раз (5,7) быстрее, чем в контроле (так, за 2 мин освещения в опытном образце восстанавливалось 407 содержащегося в образце акцептора миоглобина, за то же время в контрольном образце восстановилось всего 77 миоглобина). Восстановление миоглобина за 1-ю мин освещения опытных образцов двумя другими блокаторами кальциевых каналов - верапамилом и дилтиаземом - происходит с одинаковой скоростью, которая примерно в 3 раза меньше, чем в образце с риосидилом.Таким образом, наибольший электронно-донорной активностью обладаетВремя освещенияобразца, мин 12 Увеличение поглощения на 416 нм 0 125 0 275 О 40 О 44 О 45 Доля восстановленного цитохрома С 0,25 3 132074 риосидил, а верапамил и дилтиазем обладают одинаковой электронно-донорной активностью.Определенное предлагаемым способом различие в электронно-донорной активности блокаторов кальциевых каналов, а именно, риосидилверапамил = дилтиазем, коррелирует с их биологической активностью, наблюдаемой в электрофизиологических ис следованиях.Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и способа по прототипу построены кинетические кривые уменьшения поглощения анион-ради калов красителя иозина при импульсном освещении контрольного образца и опытных образцов, содержащих 1 10 4 М риосидила и 25 10 И риосидила, Начальная скорость исчезновения 20 радикалов красителя равна 5 в произвольных единицах (отношение уменьшения концентрации анионов красителя ко времени освещения образца), В опыт ном образце, содержащем 110 М бло катора каналов риосидила, начальная скорость изчезновения радикалов замедлилась до 2, 7 в тех же единицах, Таким образом, отличие в величине измеряемого эффекта, вызываемогоодинако вой концентрацией тестируемого вещества, в контрольном и опытном образцах составляет по способу-прототипу 5:2,7=1,8 раза по сравнению с 0,40: Начальная (за первые 2 мин осве-" щения) скорость фотовосстановления цитохрома С в присутствии фелодипина составила 197., в то время как при тех же условиях освещения фотовосста. новление цитохрома С в контрольном образце за первые 2 мин освещения составило всего 27, Таким образом, фелодипин ускоряет фотовосстановление акцептора жлектронов цитохрома С примерно в 10 раз, что свидетельствует о его высокой электронно-до 0,07=5,7 раза по предлагаемому способу.Следовательно, предлагаемый способ чувствительнее известного в 3 раза (5,7.1;8=3)П р и м е р 2. Определение электронно-донорной активности блокатора кальциевых каналов - фелодипина(водорастворимое соединение) по восстановлению цитохрома С,, Опьтнь образец объемом 2 мл, содержащий водный раствор красителяэозина (1 10 М) цитохрома С (1 10 М)и фелодипина (1 10М), поместили воптическую кювету и дэаэрировали какописано в примере 1. Таким же образом готовили контрольный образец,не содержащий фелодипина,Контрольный и опытный образцы исследовали на обычном спектрофотометре Сфтак же, как описано в примере 1, и записывали спектр поглощения образцов через каждые 3 мин освещения их непрерывным светом.При освещении образцов происходитфотовосстановление цитохрома с увеличением полосы поглощения с максимумом на 416 нм (максимум поглощенияокисленного цитохрома С - 410 нм).В таблице представлена кинетикафотовосстановления акцептора электронов цитохрома С блокатором кальциевых каналов фелодипином, в контрольном и опытном образцах. 0,55 0,80 0,88 0,90 норной активности. Кроме того, гемсодержащий белок - цитохром С можетбыть успешно использован в качествеакцептора электронов, изменяющегосвой спектр поглощения при восстановлении, для определения электронно-донорной активности химическихсоединений. П р и м е р 3. Определение электронно-донорной активности водонерастворимых соединений аймалина иФормула изобретения1. Способ определения электроннодонорной активности химических соединений путем регистрации взаимодействия тестируемых соединений в растворе с красителем, включающий осве 20 щение образца в полосе поглощениякрасителя с последующим спектрофотометрированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем,Эчто с целью повышения чувствительности способа, в контрольный и25 опытный образцы дополнительно вво. -дят гемсодержащее соединение, образцы освещают непрерывным светом иизмеряют начальную скорость измененияоптической плотности в полосе поглоЗ 0 щения гемсодержащего соединения и поувеличению скорости изменения оптической плотности определяют электронно-донорнуЮ активность,2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю 35 щ и й с я тем, что, с целью определения электронно-донорной активностиводорастворимых соединений, в качестве гемсодержащего соединения используют гемсодержащий белок.40 3, Способ по и. 1, отличающ и й с я тем, что, с целью определения электронно-донорной активностиводонерастворимых соединений, в качестве гемсодержащего соединения ис 45 пользуют гемин,Составитель Н, ГуляеваТехред М.Ходанич Редактор Е. Копча Корректор В, Бутяга Заказ 2655/49 Тираж 76 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 132бензокаина (блокатры натриевых каналов) С по восстановлению гемина,Опытный образец объемом 2 мл,содержащий в качестве растворителясмесь диметилсульфоксида и воды вотношении 4: 1, а также краситель эритрозин (иодзамещенный аналог красителя эбзина) (1,5 10М) акцепторэлектронов гемин -1,5 10 М и тестируемое соединение аймалин -1 10Мпомещали в герметическую оптическуюкювету и подвергали процедурам, описанным в примере 1,Освещение опытного образца приводит к изменению спектра поглощения акцептора электронов - гемина.При этом исходная полоса поглощенияокисленного гемина уменьшается ивозрастает более длинноволновая полоса, соответствующая восстановленнойформе гемина.По приращению поглощения длинноволновой полосы за время (в течение5, 10, 15 мин) освещения опытного образца строили кинетическую кривуюфотовосстановления гемина в присутствии аймалина.Такие же операции проводили и сконтрольным образцом, не содержащимаймалин, и строили кинетическую кривую восстановления гемина.Из сравнения кривых видно, чтоаймалин является эффективным доноромэлектронов (восстановление гемина вприсутствии аймалина за первые 2 миносвещения образцов почти в 12 разбыстрее, чем в контрольном образце),что хорошо согласуется с биологической активностью аймалина-антиаритмикаАналогично тестировали бензокаин(1 10-3 М) - блокатор натриевых каналов и строили кривую фотовосстановления гемина в его присутствии.Бензокаин обладает хотя и слабойэлектронно-донорной активностью (вос 0749 6становление гемина в присутствии бензокаина только в 2 раза быстрее, чемв контроле, за первые 2 мин освещенияобразцов), но достаточно хорошо детек 5 тируемой предлагаемым способом.При исследовании бензокаина способом-прототипом его электронно-донорные свойства не обнаруживаются,что также свидетельствует о более10 высокой чувствительности предлагаемого способа,