Способ определения относительной активности дегидрогеназ в лейкоцитах крови

.П. Архив анатомиитологии, 1969, т. 5,ТНОСИТЕЛЬАЗ В ЛЕЙКОя к биохиФь ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ О НОЙ АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕН БИТАХ КРОВИ(57) Изобретение относитс мин, предназначено для медицинской практики. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа путем сокращения числа приемов, последовательной инкубации мазка крови в средах с субстратами дегидрогеназ и регистрации оптической плотности инкубационного раствора. Для этого лейкоциты после центрифугирования в виде белой полоски на границе эритроциты - плазма наносят на стекло, втягивают в стандартный капилляр, центрифугируют, определяя гематокрит. После центрифугирования из леикоцитов готовят мазок, фиксируют30 с в 707-ном растворе ацетонав ЗР мМ фосфатном буфере при рН 7,4,затем 30 с отмывают в таком же растворе без ацетона и без подсушиванияпомещают в среду, содержащую субстрат одного из исследуемых ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ),Ы-глицерофосфатдегидрогеназы (ЫГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы. Всесреды содержат 30 мМ неорганическогофосфата рН 7,4. Первая среда (дляопределения активности-ГФДГ) содержит 10 мМ глицерофосфата, 0,3 мМмалоната и 1 мМ .тетразолия и-нитротетразолнй фиолетовый, вторая среда(для СДГ) содержит 1 мМ сукцината и1 мИ лдрф; третья (для дегндрегенаа, Яокисляющих НАДН) - 0,2 мМ п-НТФ,1 мМ малоната и 1 мМ НАДН. Длитель- Сность инкубации мазка 2 мин соответствует достижению окраски, достаточной для фотометрирования. Определяют,еасоотношение значений активности раз 1ных дегидрогеназ, полученных при фо- ртометрировании образца с соответствующими субстратами, и сопоставляютс соотношением их активностей к норВНИИПИ Заказ 2655/49 Тираж 776 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 132Изобретение относится к биохимиии может найти применение в медицинской практике.Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа за счетсокращения числа приемов и последовательной инкубации мазка крови всредах, содержащих субстраты дегидрогеназ, регистрации оптической плотности инкубационного раствора,Способ осуществляют следующим образом.Мазок готовили из лейкоцитов крови, взятой от доноров для определения в ней фибриногена по стандартнойметодике, принятой в клинических лабораториях (в 10 мл коническую пробирку, содержащую 0,5 мл 1,357-ногоцитрата натрия, вводили, помешивая,5 мл венозной крови и центрифугировали 5-7 мии при 1500 об/мин на центрифуге с радиусом ротора 10 см). 100микролитров лейкоцитов, находившихся в пробирке после центрифугирования в виде белой полоски на границеэритроциты - плазма, наносили настекло и, пользуясь капиллярными силами, втягивали их в стандартный7,5 см капилляр для определения гематокрита, заклеивали его с одногоконца замазкой и центрифугировалив режиме определения гематокрита,После центрифугироваия из лейкоцитов, находившихся в капилляре в виде белой полоски длиной 0,5-1 см,готовили мазок на предметном стеклеразмером кюветы имеющегося ФЭКа, После подсушивания на воздухе при комнатной температуре мазок фиксировали в течение 30 с в 707.-ном растворе ацетона в 3 Р мМ фосфатном буферепри рН 7,4, затем 30 с отмывали втаком же растворе без ацетона и безподсушивания помещали в среду, содержащую субстрат одного нз исследуемыхферментов - сукцинатдегидрогеназы(сс-ГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы.Все среды содержали 30 мМ неорганического фосфата (любой степенизамещенности) при рН 7,4. Первая среда (для определения активности митохондриальной Ы-ГФДГ) включала 10 мМ 0751 2глицерофосфата, 0,3 мМ малоната и1 мМ тетразолия п-нитротетразолийфиолетовый (п-НТФ, Кеапл 1 Венгрия),вторая среда (для СДГ) содержала1 мМ сукцината и 1 мМ пНТФ, третья(для дегидрогеназ, окисляющих НАДЯ) -0,2 мМ п-НТФ, 1 мМ малоната и 1 мМНАДН.Длительность инкубацин мазка в10 кювете ФЭКа с каждой средой 2 мин со-.ответствует достижению окраски, достаточной для фотометрирования наприборе ФЭК. Больший интервал лищьудлиняет процедуру,15 далее определяют соотношение значений активностей разных дегидрогеназ, полученных при фотометрированииобразца с соответствующими субстратами, и сопоставляют с соотношением20 их активностей в норме. Исследовано распределение соотношений активности 3-х ферментов у32 здоровых доноров, характеризующих 25 .норму. Отношение активности СДГ/ГФДГ у всех доноров находилось винтервале 85-115 при среднем значении 100, для отношения НАДН/Ы-ГФДГ -в интервале 85-1157. при среднем зна чении 100, для отношения НАДН/-ГФДГ -в интервале 180-240 при среднем 210,т.е. в норме отношение активностейдля этих Ферментов в лейкоцитах человека характеризуется отклонением З 5 от среднего значения на 5-107. Формула и з о б р е т е н и я Способ определения относительной 40 активности дегидрогеназ в лейкоцитах крови, включающий инкубацию мазка в среде, содержащей субстрат и соль тетразолия с последующим фото- метрическим измерением, о т л и - 45 ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности и ускорения способа,мазок последовательно инкубируют в средах, содержащих субстраты дегидрогеназ, каждый раэ регистриру ют оптическую плотность инкубационного раствора и по соотношению полученных значений определяют относительную активность ферментов.