Способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы

% 01) СОЮЗ СОВЕТСНИХОВНИРаеюиРЕСПУБЛИН А 4(51) С 12 Ю 9/22 О САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕДИНСТВУ ВТОРСкОм ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪ 9(71) Казанский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им, В.И.Ульянова- Ленина(56) 1. Авторское свидетельство СССР В 587156, кл. С 12 Н 9/22, 1976.2. Авторское-свидетельство СССР У 1010125, кл, С 12 Ч 9/22; 1983.3. Иау В.В , Уа 1 вЬ К;3 . Е 111 ойС М,Н. Бшеайоп Л.К. ИесЬапдвш ой рагайохуса 1 вйхдв 1 а 11 оп оГ кдЬопас 1 еаве вупЬевдв ВасШпв виЬС 11 дв В 1 осЬеше 1. ВъорЬув Асйа, 1968, ч. 169, р. 260.е(54) (57) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙВНЕКЛЕТОЧИОИ РИБОНУКЛЕАЗЫ ВАС 11 ДЛЗХБТЕКИЕ 0108 7 Р, предусматривающийкультивирование нродуцента на среде,содержащей лентон, глюкозу и минеральные соли,.о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения актив.ности фермента, в культуральную жидкость вносят дактийомицин в количестве 0,075-0, 125 мкг/мл через 67,5 ч от начала культивирования вФазе замедления роста микробцой популяции.Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы.Известен способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы, пре дусматривающий культивирование штаммапродуцента Вас 111 ця 1 пгегшедьця 7 р 13.Известен способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы из культуральной жидкости Вас 111 ця ыТегше Йдця 7 р в присутствии стимуляторов роста бактерий-дрожжевого экстракта или кислотного экстракта витамина В, кормового2.Однако известные способы характе ризуются невысоким .выходом фермента, при этом активность рибонуклеазы в культуральной жидкости за счет. увеличения урожая клеток повышается всего на 33-443 и достигает 5,0 х 10 ф 20 условных единиц.Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы Вас 111 ця 1 пгегшей 1 ця 7 р пу тем культивирования продуцента на пительной среде, содержащей пелтон,глюкозу и минеральные соли, стимуляции актиномицином Д синтеза внеклеточной рибонуклеазы Вас 111 ця яцЬгх 11 я 3330Однако известный способ связан лишь со снятием репрессирующего действия фосфора на синтез рибонуклеазы. В среде без фосфатов стимуляция синтеза фермента не наблюдается. З 5Цель изобретения - увеличение активности фермента в культуральной жидкости.Поставленная цель достигается тем,что спгласно способу получения щелочной внеклеточной рибонуклеазыВасг 11 ця 1 пгегшей 1 ця 7 р, предусматривающему культивирование продуцентана питательной среде, содержащей пептон, глюкозу и минеральный соли, вкультуральную жидкость вносят дактино-мицин в количестве 0,075-0,125 мкг/мл через 6-7 ч от начала культивирования в фазе замедления роста микробной популяции. 50Сущность изобретения состоит в том, что активный синтез щелочной внеклеточной рибонуклеазы Вас 111 ця пгегшей 1 ця Лр начинается по окончании экспериментального роста культуры, 55 т.е. в начальной стадии фазы замедле. ния роста, а внесение дактиномицина именно в этот период будет существенно стимулировать синтез фермента. Фаза замедления роста характеризуется падением удельной скорости роста при продолжающемся увеличении биомассы культуры (исследовано влияние внесения дактиномицина в дозах от 0,025 до 0,15 мкг/мл на 4,6 и 8 ч культивирования: 4-й час культивирования соответствует станции экспоненциального ростакультуры, 6-й и 8-й часы - фазе замедления роста).Влияние концентрации дактиномицина и времени его внесения на биосинтез РНКазы ВасП 1 ця 1 пгегшед 1 ця 7 р приведено в табл. 1,Как видно из табл. 1, наибольший стимулирующий эффект для всех доз дактиномицина наблюдается при внесении его на шестой час культивирования. Максимальная стимуляция наблюдается при внесении 0,1 мкг/мл дактиномицина на 6-й час культивирования, При уменьшении и увеличении дозы антибиотика, а также при внесении его на более ранние или более поздние сроки стимулирующий эффект снижается.На чертеже представлен график показателей роста и накопления рибонуклеазной активности на контрольной среде аНа графике обозначено биомасса - 1, активность рибонуклеазы в культу- ральной жидкости 2, удельная скорость роста бактерий 3, удельная скорость накопления фермента 4.На чертеже приведены показатели роста Вас 111 ця дпгегшейшя 7 р и накопления рибонуклеазной активности в культуральной жидкости на контрольной среде (не содержащей дактиномицина), а также кривые удельной скорости роста культуры ( р.) и удельной скорости накопления фермента(Г ).Для уточнения координат оптимальной (наиболее эффективной) зоны действия дактиномицина (т,е. концентрации и времени внесения антибиотика) были поставлены эксперименты по полному факторному плану ПФЭ 3 с цент 2ром в точке с наилучшим выходом РНКазы (О, 1 мкг/мп дактиномицина, время внесения - 6-й час культиви" рования) с суженными посравнению с предыдущими экспериментами интервалами как по времени внесения, так и по концентрации, Эти результаты представлены в табл. 2. На основании1138411 только экспериментальных данных и результатов обсчета таблиц можно утверждать, что внесение дактиномицина в дозах от 0,075 до 0,125 мкг/мл в интервале от 6 до 7,5 ч позволяет получить РНКазную активность в культуральной жидкости не менее 200 Ж от контроля.П р и м е р 1, Среду, содержащую, г/л: пелтон 20,0; глюкоза 10,0, СаС и О, 1 МКБО+ 7 Н 20 0,3 Ыас 1 3,03 МПБОФ 0,1 рН перед стерилизацией 8,3-8,4, засевают 1 Х 24-х часового инокулята, полученного при выращивании Васд 11 цз дпегшедюз Лр на среде того же состава. По мере культивирования определяют урожай клеток и активность рибонуклеазы в среде. По этим данным рассчитывают удельную скорость роста ( р.) и удельную скорость накопления рибонуклеазы ( Е ). По достижении стадии замедленного роста (6 ч) вносят дактиномицин в количестве 0,075 мкг/мл.П р и м е р 2, Культивирование 25 введут аналогично примеру 1, но дактииомиции вносят в концентрации 0,1 мкг/мл.П р и м е р 3. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактино-;мицин вносят в количестве О, 125 мкг/мп.П р и м е р 4. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактиномицин в количестве 0,1 мкг/мл вносят не на 6-й, а на 4,5-й ч культивирования.П р и м е р 5. Культивирование ведут аналогично примеру 1, но дактиномицин в количестве 0,1 мкг/мп вносят на 7,5 ч культивирования. 4 о В табл. 2 представлены значения рибонуклеазной активности при введении дактиномицина в культуральную жидкость в разное время. 4Как видно из данных табл, 2, оптимальным сроком внесения всех доэдактнномицина является 6-й час культивирования. Иаксимальная активностьдостигается при внесении дактиномицина в количестве О, 1 мкг/мп.Оптимальное время внесения дактиномицина (6-й час культивирования)характеризуется замедлением удельной скорости роста культуры (т.е.начинается стадия замедления роста)и возрастанием удельной скорости синтеза рибонуклеазы. Внесение дактиномицина в более ранний срок не приводит к стимуляции синтеза рибонуклеазы, а в более поздний приводитк меньшей стимуляции синтеза фермента. Рост культуры дактиномицином подавляется. Ингибиторный эффект увеличивается с увеличением дозы антибиотика и уменьшением срока культивациибактерий,Таким образом, можно утверждать(с надежностью 953), что уровеньактивности более 3007 от контроля достигается при внесении дактиномицина в дозе 0,1 мкг/мл в интервалевремени культивирования 5,5-7 ч, более 2507 - в дозах 0,075-0,125 мкг/млот 5 ч. 40 мин до 6 ч 40 мин, более2007 - в тех же дозах от 5 ч 15 миндо 7. ч 10 мин, т.е. внесение дактино"мицина на 4,5 ч культивирования вовремя экспоненциального роста культуры, не вызывает заметной стимуляцииактивности, а даже снижает ее привнесении дактиномицина в дозе О, 1 О, 125 мкг/мл. Внесение дактиномицина в дозе О, 1-0, 125 мкг/мп в началестадии замедления роста (между 6 и7,5 ч культивирования), т.е. до достижения максимального значения удельной скорости синтеза фермента, приводит к стимуляции синтеза РНКазы неменее, чем в два раза,1138411 с 1 1 Х Э 0 1 Х Нсц 1 Э Х 10.1 М Ф 1х х М Р а 1 1 1 -- 1 0 Лсч сО сч сЧМ 0 СЧ . М, - М СЧ б о Ф Э Фй 1 1- 1 сч сч 1 ос 1сч счх сг гХ РчлсЧ 1 О юГс Х г,л г СЦ СЧХц лл 1 ф о 1 Р Йаа 111 Э1 Х1 1 аЭ Х11а - 1 сч с,4 к ин МЮМ1 . 1 1счж 1оа ааИ +3сЧ сЧсчМ 11ЦО)41111 111- - 1 О а сЧ +3 о о Юо оо оо ооК) о о о о о о со ф сЧ о О о,о о ,о сч+3 +О.0М сЧ а фсЧа аи фсч ++1 Оцр О0 М СЧ оо оо осч оо. Проектная 634/18 Тираж ВНИИПИ Государствен по делам изобрете 113035, Москва, Ж