Способ получения гаммаглобулина

(54) (57)БУЛИНА пучеловека,тепанчук,шинков,анова на. укт рео-иссле миологи ,Л,В.Гр ватель- и инфекашевского Мяртин Я К ирусного гепав Эстонской патиты. Ри ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОтФЫТИ(71) Киевский научиский институт эпидеционных болезней им(56) 1. Ныгисте А.К.,Итоги профилактики втита гамма-глобулиномССР. - В кн. ВирусныеРМИ, 1981, 42-46. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММА-ГЛОтем выделения его из кровиотличающийся тем, что, с целью повышения специ фической активности иммуноглобули к вирусу гепатита А, целевой прод получают из сыворотки доноров, пе болевших гепатитом. А, не содержащ НВ-антиген, при этом забор крови осуществляют через 4-5 мес после выздоровления.11289 Изобретвние относится к медицине,а именно к методам профилактики гепатита А,Известен способ получения гамма"глобулина путем выделения его изкрови человека Я .Однако этот способ не позволяетполучить достаточно специфическийиммуноглобулин к вирусу гепатита А.Целью изобретения является повыше 1 Оние специфической активности иммуноглобулина к вирусу гепатита А.Указанная цель достигается тем,что в способе получения гамма-глобулина путем выделения его из крови 15человека, целевой продукт получаютиз сыворотки доноров, переболевшихгепатитом А, не содержащий ИВ-антиген, при этом забор крови .осуществляют через 4-5 мес. после выздоровления.Способ выполняется следующим образом.Гамма-глобулиновая фракция выделяется методом Кона из крови специально отобранных доноров - лиц, переболевших гепатитом А (данное сырье ранее не использовалось) и не имеющих НВ .антигена по данным высокочувствительных методов (РИА, 30 РОПГА) .Гипериммунный человеческий специфический иммуноглобулин с высокимтитром антител против вируса гепатита А получен из веновной крови доноров, ранее переболевших этой инфекцией, но не.ранее, чем через 180-200 дней с момента клинического проявления болезни. Сыворотка была свободна от НВ-антигена. Уровень 40 специфических антител против вируса гепатита А 1:1 500, определяемых ; радиоиммунным методомПоинципиальная схема получения препарата: подбор доноров, переболевших гепатитом А, и лаббраторное обследование их на наличие НВ -антигена (РОПГА, РИА); заготовка плазмы крови для получения препарата и его производство (метод Кона); контроль физи ко-химических свойств препарата и определение его специфической активности; определение реактогенности и безвредности препарата на добровольцах.Каждый донор, у которого проводился забор крови для получения высокоиммунного препарата против вируса 13 2гепатита А, поохопил тщательное клинико-лабораторное обследование для определения его состояния здоровья и установления пригодности его сыворотки для конструирования специфического человеческого иммуноглобулина, Причем сыворотки крови не должны содержать НВб-антиген (маркер гепатита В), а наличие прямого билирубина должно быть нормальным.Остальные биохимические показатели, при которых функция печени считается восстановленной, не должны превышать верхней границы нормы: содержание сахара в крови не более 120 мг 7., уровень общего билирубина 1,1 мгХ, тимоловая проба - 2-3 ед, бета-липопротеидов - 10 ед, активность аланинтрансферазы - 0,7 мкмоль с учетом нормальных показателей .крови и мочи. Только такого донора сыворотка крови пригодна для получения иммуноглобулина против вируса гепатита А.В полуфабрикате до розлива препарата проверяли: рН - потенциометрически, содержание белка - рефрактометрически. В готовом препарате определяли: физические свойства, стерильность, безвредность, пирогенность, наличие белка и НВ -антигена и специфическую активность, .которые проводили общепринятыми методами исследования (паспорт на препарат).П р и м е р 1. Специфический гамма-глобулин с высоким титром антител против вируса гепатита А был получен следующим образом: Больной С., 18 лет находился в инфекционном стационаре по поводу гепатита А. Диагноз был поставлен на основании клинико-эпидемиологических и специфических лабораторных исследований. Через 5 мес. после выписки из стационара у него была получена кровь в количестве 250 мл для конструирования специфического гамма-глобулина против гепатита А. Специально проведенные лабораторные исследования показали, что в исходном сырье (плазма крови) отсутствовал поверхностный антиген вируса гепатита В - НВ-антиген (РОПГА,РИА),а титр антител к вирусу ге.патита А был равен 1:1 600 (РИА),. Из данной плазмы крови с помощью стандартного метода Кона при низких температурах была получена гаммаглобулиновая фракция (2 фракция)1128913 4107.-ного раство- Полученный гамма-глобулин. в опытахпротив вируса на добровольцах показал себя как(РНА), ареактогенный и безвредный препарат. 3 в количестве 4,5. мл ра с титром антител гепатита А 1:16 000 Аналитический паспорт на гипериммунный человеческий специальный иммуноглобулин против вируса гепатита А: Показатели Прозрачный, бесцветный Физические свойства (прозначность, цвет) Величина рН 7,26 Электрофоретическаячистота 97,8 Х Стерильность Стерильный Апирогенен Пирогенность Стабильность Стабилен Безвредность БезвреденНе,токсичен Токсичность 107. Количество, содержание белка 1. 16 000 Титр специфическихантител против вирусагепатита А, определяемыхрадиоиммунным методом Не содержит Наличие НВ -антигена 5Таким образом, полученный вперныегипериммунный человеческий специфический иммуноглобулин против вируса 45гепатита А согласно проведеннымисследованиям отвечает требованиямМРТУ,Убедившись в том, что полученныйиммуноглобулин отвечает требованиям ЗоМРТУи свободен от НВв-антигена,изучили впервые его реактогенностьи безвредность на добровольцах сог-ласно приказу,МЗ СССР В 616 от27 августа 1971 г. (20 человек). уКонтролем служили 50 лиц, которымпо единой методике был введен коммерческий нормальный гамма-глобулин. По возрасту и полу обе группы были идентичны (мужчины, 18-22 лет).Техника введения гипериммунного человеческого иммуноглобулина и контрольного препарата была следующей. Перед введением препарата каждую ампулу тщательно просматривали. При наличии трещин, посторонних включений неразбивающихся хлопьев, сильной мутности препарат не применялся. Препараты после хранения в холодильнике в течение 120 мин выдерживались при комнатной температуре. Затем ампулы вскрывались, предварительно1128913 Релактор М. Товтин Техред - 3. Палий Корректор А. Тяско Заказ 9268/4 Тираж 687 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5"пал ППП "Патент", г. Ужгород, уп. Проектная, 4Ф протирали их стерильной ватой,смоченной спиртом.Перед основным опытом предварительно у всех прививаемых была изучена чувствительность к вводимому 5препарату путем введения 0,1 мл17-ного водного раствора гипериммунного человеческого иммуноглобулина против вируса гепатита А внутрикожно в область нижней 1/3 внутренней 1 Оповерхности предплечья.Результаты этих испытаний пдказали, что у лиц опытной и контрольнойгруппы через 30 мин наблюдения былиобнаружены папулы от 0,5 см без наличия разлитой гиперемии кожи вокругместа введения препарата и повышениятемпературы, что свидетельствовалоо том, что все добровольцы не обладали повышенной чувствительностьюна введение препарата,После этих испытаний через 30 минвнутримышечно в верхний наружныйквадрант ягодины с соблюдением строжайших мер асептики шприцамиодноразового пользования производства Ленинградского завода медицинскихполимеров типа "Рекорд", вводили1 мл испытуемого препарата, а лицамконтрольной группы - нормальный ЗОчеловеческий гамма-глобулин Киевскогопредприятия бакнрепаратрв МЗ. СССР.На каждого наблюдаемого заводилсяспециально раЗработанный "Дневникнаблюдения". Учет реакций среди имму низированных и контрольных лиц начинали через 0,5,1,2,3,4 часа, азатем ежедневно на протяжении 151 дня,Данныеиспытаний обобщались путемсопоставления результатов клинического осмотра, опроса и биохимическоно исследования как среди иммунизиро"ванных специфическим препаратом, таки нормальным гамма-глобулином.Для оценки безвредности препарата 45перед испытанием у всех добровольцев,а затем через каждые 20 дней наблюдения в динамике проводился общийанализ крови и мочи. Кроме того,параллельно проводились биохимическиеисследования, используемые для определения функционального состоянйяпечени; активность аланинаминотрансферазы, наличие билирубина в сыворотке крови и тимоловая проба, В испытаниях принимали участие толькоздоровые лица, не имеющие никакихпротивопоказаний к применению гипериммунного человеческого специфического иммуноглобулина против вируса гепатита А.В результате проведенных исследований установлено, что новый препарат с высоким титром специфическихантител (1: 16 .000) к,вирусу гепатитаАне обладает реактогенными свойствами.Наблюдениями, проведенными в первые 4 ч после введения данного препарата, а затем ежедневно на протяжении 151 дня не выявлено каких-либопатологических явлений у иммунизированных лиц,Безвредность и реактогенностьполученного гипернммуного человеческого специфического иммуноглобулина изучена впервые и документирована как специфическими лабораторными исследованиями на НВб-антиген,так и различными биохимическими тестами (активность аланинаминотрасфе"разы, наличие билирубина в сывороткекрови, положительная тимоловая проба)у всех наблюдаемых лиц.Следовательно, полученные результаты характеризуют отечественныйгипериммунный человеческий иммуноглобулин против вируса гепатита А.с содержанием антител 1:16 000 какареатогенный, безвредный и высокоиммунный препарат, который можетбыть использован для профилактикич лечения данной инфекции,