Способ определения дозы сенситина, необходимой для получения эритропитарного диагностикума

ССЮЭ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИИ зш С 01 Б 33/48 ЕЛЬСТВУ юл. К 9 42 ов, А.В. Те Савицкая,фейгельман, Пр нова, В.Н. чеванаучно-исслакцин и сы едоваоро 8)производства стикумов Р 81 4.77 начальни 5 08 эрит-77,комдству гламент диагно ый 16.0 правлен пс и вир СССР, сия по произв усных препар85. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СЕИД(71) Ленинградскийтельский институт ток (53) 612. (56) 1, Рероцитарныхутвержденн Главного убактерийньМинздрава 8 О 3 3 24229 БРЕТЕНИЯ(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫСЕНСИТИНА, НЕОБХОДИМОЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА, путеманализа сенсибилизированных разнымидозами сенситина эритроцитов, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности способа,определяют среднюю электрофоретическую подвижнОсть сенсибилизированныхэритроцитов и используют дозу сенситина, при которой отношение электрофоретической подвижности к среднеквадратичному отклонению равно 0,080,160.1124229 1Изобретение относится к вакцинно сывороточному целу и может быть использовано в технологии получения эритроцитарных диагностикумов ветеринарного и медицинского назна 5 . чения.Известен способ определения дозы сенситина, необходимой для получения эритроцитарного диагностикума, путеманализа сенсибилизировайных разными дозами сенситина эритроцитов. Определение дозы сенситина осуществляется методом пробчых посадок, предусматривающим изготовление пробных образцов препарата, различающихся дозировкой сенситина. Пробные образцы готовят сенсибилизацией эритроцитов в дозе 62, 125 и 250 мкг антигена на 1 мл эритроцитарной взвеси. Затем проводят реакцию непрямой гемагглютина-ции (РНГА) с соответствующей контрольной кроличьей сывороткой. Для получения производственной серии диагностикума выбирают ту из указанных трех доз сенситина, которая агглютинируется контрольной сывороткой в разведении до 1/2 титра 1 1.Известная методика не позволяет определить оптимальную дозу сенситина из-за того, что взят очень большойЗО интервал изменений его концентрации. Если же выбрать меньший интервал изменения концентрации антигена, то с помощью РНГА не удается обнаружить разницу в соответствующих разведениях контрольной сыворотки, З 5 т,е, РНГА применительно к рассматриваемой задаче является неточной, мало чувствительной. В то же время,заниженная доза антигена ухудшает чувствительность и специфичность 40 диагностикума, а завышенная может . привести к спонтанной агглютинации.Другим недостатком известного способа является труднодоступность контрольных сывороток, так как они должны быть получены от больных соответствующей инфекцией, вплоть до инфекции, вызванной определенным штаммом возбудителя. При этом очевидно, что контрольные сыворотки мо гут отличаться нестабильностью титров, поскольку они.получены от разных больных.Таким образом, основная причина несовершенства известного способа 55 заключается в трудности установления точной оптимальной дозы сенситина. 2Цель изобретения - повышение оч-,ности способа.Указанная цель достигается тем,что по способу определения дозы.сенситина, необходимой для получения эритроцитарного диагностикума,путем анализа сенсибилизированныхразчыми дозами сенситина эритроцитов, определяют среднюю электрофоретическую подвижность сенсибилизированных эритроцитов и используютдозу сенситина, при которой отношение электрофоретической подвижностик среднеквадратичному отклонениюравно 0,8-0,160,П р и м е р 1. Образцы двух партий эритроцитов баранов, фиксированных формалином и разведенных до107.-ной суспензии Физраствором, соединяют с равными объемами растворовполисахаридного антигена шигелл Зонне при концентрациях последнего 25250 мкг/мл. Для проведения даннойоперации используют пробы объемомпо 5 мл. Реакционные смеси выдерживают в течение 1 ч при 37 С. Затемсенсибилизированные эритроциты трехкратно отмывают от избытка антигенаФизиологическим раствором при рН 7,2,Осадок разводят до первоначальногообъема (т,е. до 5 мл) раствором,содержащим: мясо-пептонный бульон Хоттингера 25 об.7; сахароза 5 вес.7.; боратно-янтарный буфер рН 7,5 остальное.Приготовленные пробные образцылиофилизируют, Далее измеряют электрофоретическую подвижность эритроцитов в пробных образцах. С этой цельюих предварительно размачивают каждыйв 5 мл дистиллированной воды, послечего центрифугируют в течение 5 минпри= 350. Полученные осадки сенсибилизированных различными дозамиантигена эритроцитов растворяют каждыйв 6 мл измерительной среды с параметрами: ионная сила ц 0,02;рН 7, Зф 25 фС .Электрофоретическую подвижностьизмеряют методом микроэлектрофореза на приборе ПАРМОКВАНТ(КарлЦейсс, Йена) в режиме автоматического анализа электрофоретической подвижности (7) и среднеквадратичное отклонение ( 6 ) в пробных образцах стаэритроцитарных клетокЗатем рассчитывают отношение 7/ для каждого пробного образца.В табл, 1 дана характеристикапробных образцов эритроцитарногодизентерийного диагностикума Зонне1124229 Таблица 1 Партияэритроцитов Сенсибилизирующая доза, мкг/мл Показатели контролируемых образцов 200 25 250 100 150 50 1,91 1,789,5 8,90,20 0,20.1,55 1,045)6 12,80,28 0,08 1,30 1,62 1,21 1,42 9,6 9,9 12,6 0,14 0,10 О, 14 О, 15 0,77 1,05 0,91 14,7 15,8 0,07 0,06 13,9 0,06 Сенсибилизирующая доза, мкг/мл ПоказателиконтролиПартияэритроцитов 300 50 руемыхобразцов 1,34 1,45 1,48 1,64 11,8 10,9 8,9 Как видно из таблицы, для первой .партии эритроцитов минимальной сенсибилизирующей дозой, для которой отношение 7/6 находится в предлагаемом диапазоне, является 100 мкг/мл (при этой нагрузке отношение составляет О, 15). Поэтому данную дозу используют для получения целевого продукта (большие дозы применять нецелесообразно из экономических соображений, хотя для них коэффициент нагрузки и находится в предлагаемом диапазоне).В результате сенсибилизации эритроцитов первой партии антигеном шигелл Зонне в дозе 100 мкг/мл с.последующим выполнением операций отмывки и лиофилизации в режимах, указанных выше для приготовления пробных образцов, получают сухой эритроцитарный антигенный диагности-. кум дизентерии Зонне, имеющий титр в РНГА с сыворотками больных от 1/200 и выше, а с сыворотками здоровых доноров 1/2. При этом титр .,препарата в РНГА с иммунными кроличьи-, ми сыворотками составляет 1/6400. 20Согласно табл. 1, для второй партии эритроцитов сенсибилизирующейдозой является 50 мкг/мл, так какпри этой дозе Ч/б = 0,08.В результате сенсибилизации эритроцитов второй партии антигеномшигелл Зонне в дозе 50 мкг/мл получают диагностикум с титром вРНГАс сывороткой больных от 1/100 и выше,с сыворотками здоровых доноров 1/2,30а с имунными кроличьими сыворотками1/3200.П р и м е р 2. Образцы двухпартий эритроцитов баранов, фиксированных формалином и разведенных до10 Х-ной суспензии физраствором, соединяют с равными объемами растворовполисахаридного антигена шигеллНьюкэстл при концейтрациях последнего40 25-300 мкг/мл, Последующие операции:по изготовлению и контролю пробныхобразцов. проводят, как описано впримере 1,1 45 Результаты контроля пробных образцов приведены в табл. 2.Таблица 2 100 200 250,16 2 видно, что дляоцитов оптималь"ющей дозой антигеналяется 200 мкг/мл.зки эритроцитовена равны О, 13"и енсибилизациитов обеих партийНьюкэстл в дозеот эритроцитарныйстикум дизентериититр в РНГА с сыво/200-1/800, а сми сыворотками ия предлагаеускорено мо пособа упроще Составитель Е. ЖитннковаРедактор И, Рыбченко Техред Ж.Кастелевич Корр Тяс аказ 8272/34 ВНИИПИ Гос по делам 113035, МоскТираж 822ударственногоизобретенийа, Ж, Рауш Подписн омитета ССоткрытийкая наб.,/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектн Из данных табл,обеих партий эритрной сенсибилизирушигелл Ньюкзстл явКоэффициенты нагруданной дозой антигО, 16 соответственно.В результате сбараньих эритроциантигеном шигелл200 мкг/мл получаантигенный диагноНьюкэстл, имеющийротками больных 1имунными кроличьи1/6400.В результате прим 1,97 1,93 1,87 1 8,3 9,0 9,3 1 Оэ 24 Ою 21 0,20 0 определение точной дозы сенситина,используемой для сенсибилизации20 эритроцитов при получении диагностикума, за счет исключения необходимости испытания пробных образцов препарата с труднодоступными сыворотками больных; экономится дорогостоящее сырье (сенситин) благодаря точному и быстрому определению величины сенсибилизирующей дозы (поскольку ранее приходилось преднамереннозавышать сенсибилизирующую дозу ан 30 тигена для обеспечения гарантии вотношении чувствительности диагностикума); повышена культура производства за счет аппаратурного оснаще- ,ния и количественного выражения процесса сенсибилизации,