Способ получения иммуносупрессивного фактора

ОЮ (И) ЕСК дА 61 К 35/ АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Лиссованьй инстичей ьство СССР 1977,е еНесйв Еапей 2 гоа шшопе гевроп пв, 1978,)ГОСУДДРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Киевский государствентут усовершенствования вра(56) 1. Авторское свидетелУ 578968, кль А 61 К 35/302. Воге 1 Л. Е. еГа 1, ТЬоЕ Егасгоав (сЬа 1 опев) оЬ1 ушрЬоЫ ог 8 апв оп где 3.п чъчо - А 8 епгв апй АсЫо8, 5, р, 523-531,(прототип:(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕССИВНОГО ФАКТОРА путем гомогената исходной ткани с последую. щим отделением надосадочной жидкости центрифугированием, фильтрованием и вьделением целевого продукта, о т-л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения спектра иммуносупрессивного действия целевого продукта, в качестве исходной ткани используют лимфатические узлы морокой свинки, центрифугирование проводят непосредственно после экстракции, фильтрат ве диализируют через полупроницаемую мембрану против дистиллированной водо, далее днализат концентрируйт, фракционируют его на колонке с сефадексомф -15 и отбирают фракции с молеку- Е лярной массой 100-500 дальтон.1 1118Йзобретение относится к медицинеР и касается способа получения иммуносупрессивного фактора.Известен способ получения иммуносупрессивного Фактора с использова- . нием органов животных .1 .Известен также способ получения иммуносупресснвного фактора путем экстракции гомогената тимуса и селезенки телят, с последующим отделе О нием надосадочной жидкости центрифугированием, фильтрованием и вьделением целевого продукта 2 .Однако известные способы не обеспечивают получение. целевого продук та с широким спектром иммуносупрессивного действия.Цель изобретения - расширение спек тра иммуносупрессивного действия целевого продукта. 20Эта цель достигается тем, что согласно способу получения иммуносупрессивного фактора путем экстракции гомогената исходной ткани с последующим отделением надосадочной жидкости центрифугированием, фильтрованием и вьделением целевого продукта, в качестве/ исходной ткани используют лимфатичес- Г ие узлы морской свинки, центрифуги 1 рование проводят непосредственно по- ЗО сле экстракции, фильтрат диализуют через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды, далее диализат концентрируют, Фракционируют его на колонке с сефадексом-15 и отбирают фракции с молекулярной мас- сой 100-500 дальтон.гП р и м е р. 5 г ткани лимфатических узлов морских свинок гомогениэируют с помощью микроизмельчителя тка"40 ней РТ(5000 об/мин, 5 мин), экстрагируют 24 ч при +4 С (на 1 часть ткани - 10 частей 1,14 М раствора ЖаС 1 рН 7,2) и затем центрифугируют со ско" ростью 15000 об/мин в течение 30 мин 45опри + 4 С. Надосадочную жидкость фильтруют через фильтровальную бумагу и диализируют через полупроницаемую мембрану (почечный целлофан) против 10 объемов дистиллированной воды (рН , 2) 5 О в течение 24 ч, Диализат концентрируют выветриванием в целлофановых куль-. ках под. вентилятором при + 4 Сто объема 10 мл. Концентрировайный диализат экстракта лимфатических узлов 55 морских свинок подвергают фракционированию на хроматографической колонке 2 х 100 см, заполненной сефадек 367 2сом Си стабилизированной О, 14 Мраствором ИаС 1 рН 7,2. Характерныйпрофиль кривой элюции регистрируютна спектрофотометре СФпри длиневолны 280 нм, Собирают фракцию, выходящую из колонки в объеме элюиции500-600 мл, идентифицируют по спектру поглощения в Уф-области (максимальное поглощение в области 200-210,230-240 и 270-280 нм) и концентрируют выветриванием в целлофановыхкульках в 10 раз.С целью определения молекулярноймассы вьделенного вещества на ту жеколонку наносят вещества с известноймолекулярной массой, в данном случае АТФ (молекулярная масса (551,15)и аминокислоту валин (молекулярнаямасса 117,15).Данное вещество выходит из колонки в объеме элюции позднее АТФ, нораньше валина, т.е. его молекулярная масса менее 500, но более 100дальтон,Супрессивную дозу фактора вводятмышам линии СВА подкожно, одновременно с внутрибрюшинным введениемвзвеси эритроциров барана в 014 М8растворе ЖаС 1 в дозе 2 х 10 клеток.У животных определяют содержаниеТ- и В-лимфоцитов в тимусе, селезенкеи лимфатических узлах, количество антителообразующих клеток в селезенке,блисттрансформирующую способностьТ-лимфоцитов с ФГА и титры агглютининов и гемолизинов в сыворотке крови, Кроме того, определяются срокижизни кожного аллотрансплантата подвлиянием вьдененного фактора.1В табл. 1 показано влияние введения иммуносупрессивного Факторалимфатических узлов морских свинокна показатели клеточного и гумморального иммунитета у мышей линииСВА.Полученный препарат проявляет вы"раженный иммуносупрессивный эффектна некоторые показатели клеточного(снижение содержания Т- и В-лимфоцитов в лимфоидных органах, угнетение бласттрансформирующей способности Т-лимфоцитов) и гуморального иммунного ответа (снижение титров аг"лютининов и гемолизинов в сывороткекрови) у мышей, т.е. его иммуносупрессивный эффект более выражен посравнению с прототипом и распространяется на Т- и В-системы иммунитета.18367 4Эффективность использования иммуносупрессивного фактора, полученного по предлагаемому способу из ющмфоузлов морской свинки в сравнении с прототипом доказывается примерами табл. 2. Таблица .1 Группа зивотных Показатели Опытная, 0,05 Титры аглютининов со,001 1338 э 50+ Оэ 20 13132 э 51+ 872 1 ф 45 э 25+ 0,82 199 э 53+ 8 э 32 с 0,05 Титры гемолизинов 3 11 В то ке время выделенный фактор не оказывает влияния на содераание антителообразующих.клеток в селезенке и не изменяет продолзительнЬсть зизни колщого аллотрансплантата у мышей (табл. 1). В-лимфоциты, Х селезенка лимфоузлы Реакция . бласстранс. формации с ФГА 3 О,8 3,1 39,2 1 3,1 40 э 8+ 5 э 3 со,01 с 0,05 соэ 051118367 Таблица 2 Показатели Прототип,; полученный иэ тимуса селезенки Не влияет Содержание антител всыворотке крови: Угнетение на 903 Угнетение на 153 аглютинины гемолизины Угнетениена 1003 Угнетениена 903 Снижено на 60 ЗОЖ селезенка ЗОХ лимфоузлы Содержание В-лимфоцитов в Снижено на 403 селезенке 603 лимфоуэлах Продолжительность Нет статистически достоверных различий по сравнениюжизни кожного алло- с контролемтрансплантанта Реакция "Трансплантатпротив хозяинами То же Составит 4 дть В. ДроздовРедактор Л. Авраменко Техред А.Кикемезей Корректор А. Тяско Заказ 7312/4 Тираж 687 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Содержание антитело- Стимуляцияобразующих клеток 100-5303в селезенке в зависимостиот дозы Реакция басттрансформации с неспецифическим митогеном Угнетениена 763 Содержание Т-лимфоцитов в лифмондныхорганах: Стимуляция40-4703в зависимостиот- дозы Иммуносупрессивный фактор