Способ получения 4 или прегненолона

(19) (11) Р 35 00 3(5 БРЕТ ПИСА К АВТОРСКО ЕТЕЛЬСТВУ ической химии Ча у ЯЬ 1 пода М,г 1 гоп Х РясссЬо 1 е вге го 11 ч 1 Су,- В 1 осЬев,979, ч. 87,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(71) Институт биоорганАН Белорусской ССР(56) 1, Вгувоп М, 7. Яраг М.Ь.С 1 еачаде о 1 сЬо 1 еягего 1 в 1 де сЬа 1 паявос 1 а 1 ед ж 1 гЬ сугосЬгове Р,г 1 ачоргоге 1 п, ап поп Ьеве 1 гопргоге 1 п дег 1 чед Егов Ьоч 1 пе адгепа 1 соггех, 7.В 1 о 1.СЬев. 1968, ч; 243,Ь 10,р. 2799-2804,2. Ахрем А.А., Шкуматов В.М.,щин В.Л. Структурная организациямитохондриальных стероидгидроксилирующих комплексов. Биоорганическая химия, 1978, т. 4, М 5, с. 688693,3. А)сЬгев А.А. 1 агсо Ч.М, 1 агсо А,О. ЯЬМцва 1 оч Ч.М., СЬавЬсЬ 1 п Ч,1 во 1 аЫоп, вйгис 1 ога 1 огдап 1 заг 1 опапд щесЬап 1 вв оЕ асг 1 оп оЕ в 1 СосЬоп-дг 1 а 1 я 1 его 1 д Ьудгоху 1 а 11 пд яуягещя.-Аса Ь 1 о 1. веН.дегв.1979, ч. 38,2 3, р, 257-273,4, Ахеп В., Рога 1 Ь Т. ЕгпЬасЕ Я,СЬев 1 са 1 соцр 11 пд оГ рер 1 дев апдрго 1 е 1 пв 1 о ро 1 увассЬаг 1 дея Ьу веапяог суаподеп Ьа 11 дев. - "Налоге", 19679 214, р, 1302-1304.5, Иа 1 а 1 п Я 1 яЬ 11ЯЬ 1 Иа М В 1 пд 1 пд оЙ1 о рцг 1 Е 1 ед с укос Ьг ощеапд епсЬапсевепС оГ гЬев 1 де-сЬа 1 п с 1 еачаде ас 1В 1 орЬув. Нев.Соввцпв, 1Р 2, р. 524-831.(54) (ф 7) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 14- С) ИЛИ Н ПРЕГНЕНОЛОНА из 4- СН 1 холестерина с помощью реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащей иммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные на адренодоксин-сефароэе йрепараты адренодоксинредуктазы и .холестеринспецифичного цитохрома Р, и ИАПРН-генерирующей системы, включающей МАОРН, глюкозо-б-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, используют глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, иммобилизованную на сефарозе.2, Способ по и, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что НАРРН используют в концентрациях 0,25 10-5 10 4 М.3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что глюкозо-б-.фосфа используют в концентрациях 10 -10 Ъ 1.Изобретение относится к биохимии,конкретно к усовершенствованномуспособу получения радиоактивно меченого прегненолона иэ радиоактйвиомеченого холестерина, и может найтиприменение для ферментативного сии=теза радиоактивно меченых стероид-ных гормонов, необходимых при соэ"дании медицинских радиодиагности.ческих наборов стероидного профиля,а также для исследовательских целейв химии, биологии и эндокринологии.ферментативная трансформация холестерина в прегненолон, являющийсяпредшественником всех кортикостероидных гормонов, осуществляется вмитохондриях клеток коры надпочечни.ков млекопитающих многокомпонентнойферментной системой, включающейКОРН-специфичный флавопротеид ( адренодоксинредукт азу), негемовый же-.леэосеросодержащий белок (адренодоксин) и холестеринспецифичный цито -хром Р111Химический аналог этой реакции(две реакции гидроксилирования молекулы холестерина при Си Сиокислительное расщепление боковойцепи 20,22-диоксихолестерина) также,как и микробиологическая трансформация холестерина в прегненолон, отсутствуют .Химические способы получения4- С 1 или РН прегненолона в литературе не описаны.Иэ ве стен способ получени я (4- С 1или 3, Н 1 прегненолона из 4- С.( или1 Н холестерина при помощи реконструированной холестерингидроксилирующей систеж, содержащей иммобили-,зованный на сефарозе белок - адренодоксин, сорбированные на адренодоксинсефароэе препараты белков - адренодоксинредуктазы и холестеринспецифичного цитохрома Ри ИАОРН-генерирующей системы, включающей БАОРН,глюкоэо-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогенаэу. Радиактивный прегненолон получают пропусканием раствора субстрата через колонку с указанной ферментативной системой 2.Недостатком данного способа является низкий выход радиоактивно мече-ного прегненолона, составляющий 1525, что позволяет получить лишьмикрограммэвые количества прегненолона.Цель изобретения - повышение выхода целевого. продукта,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения4- С 3 или РН 1 прегненолона из4- С) или (зН 1 холестерина с помощью реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащейиммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные,на адренодоксин-сефароэе препараты адренодоксий 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65,редуктазы и холестеринспецифичногоцитохрома р, и БАОРН",генерирующей системы, включающей ЫАОРН, глюкозо-б-фосфат и глюкоэо-б-фосфатдегидрогеназу, используют глюкоэо-бфосфатдегидрогеназу иммобилизованную на сефарозе,Причем ЬВОРН используют в концентрациях 0,25 10 -5 10 М,При этом глюкозо-б-Фосфат используют в концентрациях 10- 10 ф М.В результате способ обеспечиваетповышение выхода целевого продукта до 80.На чертеже графически иэображене.превращение холестерина в прегнанолон при пропускании через колонки,Колонки содержат реконструированную ковалентно-сорбционным способомхолестерингидроксилирующую системуи ковалентно иммобилизованную глюкозо-б-фосфатдегидрогенаэу растворов субстрата с различными концентрациями %ЮРН и глюкозо-б-фосфат, Кривая 1-5 10 М ЮАОРН и 10 М глюкозоб-фосфат; кривая 2 - 10 М ИАОРН и10 М гюкозо-б-фосфат; кривая 30,2510 М ЫАОРН и 10М глюкоэо-бфосфат, Концентрации холестерина идобавляемого в среду твина 20 вовсех случаях составляют 0,25 10 МФи 2 10 М соответственно.П р и м е р , Для ковалентно-сорбционной реконструкции холестерингидроксклирующей системы используютгомогенные белковые компоненты этойсистемы - адренодоксинредуктазу,адренодоксин и цитохром Р, выделенные из митохондрий коры надпочечников крупного рогатого ската 31,Ковалентную иммобилиэацию адренодоксина осуществляют путем сочетаниябелка с СИВг-активированной сефарозой по общепринятой методике 141.Аналогичным образом проводят иммобилизацию глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, Концентрации иммобилизованныхадренодоксина и дегидрогеназы составляют 350-400 нмоль и 1,бмг на1 мл уплотненного геля, соответственно, Удельная активность иммобилизованной глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, определяемая из начальной скорости образования ИАОРН, составляет14 международных единиц на 1 мг иммобилизованного фермента.К 10 мл 0,05 М натрий-фосфатногобуфера рН 7,2 (буфер А) добавляютО, 5 мл уплотненного геля адренодоксин-сефарозы, содержащего 200 нмольиммобилизованного адренодоксина, Кполученной суспенэии при непрерывном перемешивании добавляют 2 мл эквимольной смеси (по 25 нмоль каждого белка) препаратов адренодоксинредуктазы и цитохрома Р, диализованных против буфера А, Смесь перемешивают в течение часа при комнатной температуре, после чего несорбированные на адренодоксин-сефаро-фзе белки отделяют центрифугированиемпри 300 д х 10 мин. Для полного отделения несорбированных белков гельдважды проьывают 10-ти мл порциямибуфера А с последующим центрифугиро"ванием при 3000 д х 10 мин. Степеньсорбции адренодоксинредуктазы и цитохрома Р, определяемая по убыли содержания этих белков в воднойфазе, составляет 90-95,Осажденный гель с реконструированной ковалентно-сорбционным способомхолестерингидроксилирующей системойсуспендируют в 5 мл буфера А и до-15.бавляют к полученной суспенизии пор+цию ковалентно иммобилизованной глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, содержащую 5 единиц Фермента, Приготовленной таким, образом смесью заполняют 20колонку с диаметром 1 см и уравновешивают 50 мп буфера А с твином 20 вконцентрации 200 мкМ (0,03 объем/ 1объем), Раствор холестерина готовятна 200 мл буфера А, содержащего200 мкМ твин 20, конечная концентрация стерина составляет 25 мкМ. Краствору субстрата добавляют ( Н 1или (4- С 3 холестерин из расчета,чтобы удельная радиоактивность суммарного стероида составляла не менее 200000 имп,мин нмоль. К раствору субстрата добавляют далее ИАРРНи глюкозо-б-фосфат до необходимых конечных концентраций. Полученный раствор пропускают при комнатной температуре через колонку с иммобилизованными белками со скоростью 8 мл/ч.Элюат собирают по фракциям 8 мл спомощью коллектора Фракций, Для анализа превращения холестерина в прегне 40нолон во времени используют 1 млпорции каждой Фракции . Стероиды изэтих порций экстрагируют 4 мя этилацетата, упаривают досуха, остатокрастворяют в этилацетате и подвергают разделению тонкослойной хроматографией на пластинках с закрепленнымслоем силикагеля в системе гексан .диэтиловый эфир - уксусная кислота (15:15:1). После проявления хромато грамм парами иода пятна, соответствующие по хроматографической подвижности прегненолону и холестерину, удаляют с пластин и определяют радиоактивность с помощью жидкостного сцинти"5 ляционного счетчика. Степень трансФормации холестерина в прегненолон рассчитывают ло формуле А ф 100 /А + Б + В; где А - радиоактивность в пятне прегненолона; В - радиоактивность 0 в пятне холестерина; В - радиоактивность всего силикагеля от старта пластинки до фронта растворителя, за исключением пятен, соответствующих холестерину и прегненолону. Для каж дого опыта используют количествосмеси сорбентов, соотвествующее О, 7 миуплотненного геля и содержащее 5 ед.глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы,200 нмоль адренодоксина и по 22 нмольцитохрома Ри адренодоксинредуктазы. Образующийся прегненолон очищаютс помощью тонкослойной хроматографиии идентифицируют на основании сравнения хроматографических подвижностейсо стандартом прегненолона в различных системах растворителей.:Радиохимическая частота полученного продукта составляет не менее 95. Изчертежа видно, что во всех случаяхстепень трансформации выходила на,2-6 ч проведения реакции, Общей закономерностью для кривых 1-3 является снижение уровня образования прегненолона после выхода активности колонок по трансформации холестерина намаксимум, Сравнение кривых 1 и 2 показывает, что уменьшение концентрацииИАРРН в 5 раз приводит к умень ениюстепени трансформации в максимуме(60), но менее резкому, чем длякривой 1 падению активности колонки,Из сравнения кривых 1-3 видно, чтоуменьшение концентрации Ю.РРН и глюкозо-б-фосфата в 20 и 10 раз соответственно сопровождается некоторым снижением степени"трансформации в максимуме (50), при аналогичном ходеинактивации, как и для кривой 2, Втаблице приведены суммарные выходыпрегненолона, рассчитанные из кривых1-3,Из представленных в таблице данных следует, что использование аналитических вариантов колонок с иммобилизованными холестерингидроксилирующей системой и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназой позволяет получатьв отличие от известного способа миллиграммовые количества радиоактивномеченного прегненолона (выход до 80),При этом значительно сокращается расход дорогостоящих БАРРИ, глюкозофосфата и глюкозо-б-Фосфатдегидрогеназы, Введение в буфер для приготовления субстрата 200 мкМ твина20 сопровождается повышением растворимости холестерина более чем на порядок, кроме того, этот детергент повышает активность холестерингидроксилазы в растворе ь 51, Использование иммобилизованной глюкозо-б-ФосФатдегидрогеназы сопровождается эффективной регенерацией кофактора вобъеме колонки, в результате чегоисключается возможность локальногонакопления окисленного кофактора какингибитора реакции, В различных вариантах опытов, указанных в таблице,используют 5 ед. иммобилизованнойглюкозо-фосфатдегидрогенаэы. Ана-.логичные опыты с применением раство1090716 Условия, . Суммарный молярный Суммарный выходвыход прегненолона прегненолона, мгмкмоль 1. НАОРН 5 ф 10 Й глюкозо-Фосфат 10 М 1,3 0,42 2, НАЭРН 10 Мр глюкоза-Фосфат 102 М 1,4 0,4 3 КА 0 РН 0,25 10глюкозо-Фосфат10 М 1,24 ансфоркацилюЩ" долесяврина Яз И-лвреененолон, Яд1 И Прегненвлон,ИНОЛЬ/НЯО га ФИнл ВНКИПИ Заказ 3015/23 Тираж 522 Подпн филиал ППП фПатент город ул Проектная,римой дегидрогеназы требуют,как мини мум,концентрации. Фермента 0,5 ед.в 1 мп, т,е. в каждом опыте по 80 ед,Таким образом, предлагаемый способ позволяет добиться 20-ти кратного снижения расхода ФЖРРН и 10-ти 5 кратного - глюкоэо-фосфата без заметного изменения суммарного выхода прегненолона(таблица, условия 1 и 3).Проточные реакторы с иммобилизованной холестерингидроксилирующей 10 системой можно испольэовать многократно. Проведение 5 цикЛов трансформаций продолжительностью по 4 ч(с трехсуточными интервалами междунные) с использованием одной колонки характеризуется следующими величинами степени трансформациихолестерина в прегненолон;1 цикл 50; 2 цикл 361 3цикл 30; 4 цикл 25 5 цикл21.