Способ получения иммобилизованной уреазы

.-"Апа 1 у-;7, 94404041 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ АНИЕ ИЗО ОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Физико-химический инсАН Украинской ССР и Инстити неорганической химии АНССР(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОй УРЕАЗЫ, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивания реагентом, о. т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения удельной активности и стабильности иммобилизованной уреазы, используют окисленный активированный уголь, подвергнутый модификации четырех- хлористым титаном, при массовом соотношении угля и четыреххлористого титана 1:0,2-0,5.2Способ по и. 1, отличающ и й с я тем, что в качестве окисленного активированного угля используют окисленный сферический карбо.- 9 нпт или окисленный фенолформальде- гидный угольИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения имьюбилизованной уреазы, иможет найти применение в медицине(для аппарата искусственная почка)5в аналитической проьыаленности (для5создания ферментных электродов) ипри очистке сточных вод от мочевины,Известен, способ Получения иммобилизованной уреазы, заключающийся всвязывании фермента с модифицирован"ным-аминопропилтриэтоксисиланом:пористым стеклом 111 .Недостатком способа является невозможность использования препаратав медицинских целях из-за токсичности, обусловленной присутствием-аминопропилтриэтоксисилана, и способности к тромбообразованию.Наиболее близким к изобретению потехнической сущности и достигаемому 20положительному эффекту является способ получения иммобилизованной уреазы, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивающим реагентом - карбодииьядом или сольюизоксазолия 12Однако прч иммобилизации по известному способу уреазы заметно снижается активность фермента, невысо- Зока и стабильность иммобилизованнойуреазы при многоразовом использовании(т "бл, 2 и 3), Кроме того, при применении указанных углей возможновозникновение запыленности, тогдакак при применении их в медицине сопоставимые по размерам с форменнымиэлементами крови пылевые частицыдолжны от сут ст вовать. Недостаткомявляется также необходимость приме.нения дорогих, дефицитных карбодиис мидов: дициклогексилкарбодиимид, дибензилкарбодиимид, 1-циклогексил(2-морфолиноэтил) -карбодиимид, 1 бензилдиэтиламинозтил карбодиимид,1-циклогексил- (2-морфолин оэтил) - 45карбодиимид и соли изоксизолия, причем некоторые из них промышленностьюне выпускаются,Целью изобретения является увеличение удельной активности и стабильности иммобилизованной уреазы,1Поставленная, цель достигается тем,что согласно способу получения иммобилизованной уреазы, заключающемусяв связывании фермента с активированным.углем, подвергнутым модификациисшивающим реагентом, используют окисленный активированный уголь, подвергнутый модификации четыреххлористымтитаном, при соотношении угля и че- бОтыреххлористого титана 1:0,2-0,5.Причем в качестве окисленного активированного угля используют окисленный сферический карбонит или окисленный фенолформальдегидный уголь. 65 Данный способ позволяет полуЧатьнерастворимую уреаэу, отличающуюсявысокой активностью и стабильностью,Особым преимуществом обладает акисленный сферический карбонит, отличающийся высокой химической стойкостью,малым изменением прочности в широкоминтервале развития пористости, полным отсутствием пыли, при этом дляокисленных сферических карбонитовпрочност ь, обеспечив ающая отсутствиепыли, сохраняется вплоть до Ч1,2-1,3 см /г, повышенной адсорбционЯной емкостью к средним и крупным молекулам при сорбции их из водных растворов, и особенно к ионам ИН,образующимся в процессе разложения мочевины, что способствует дополнительнойстабилизации уреазы, уменьшая концентрацию и тем самым ингибированиефермента ионами ИН 4.Применение в качестве связывающего реагента четыреххлористого титана помимо упрощения процесса за счетприменения менее дефицитного сшивающего реагента позволяет увеличитьвыход уреазной активности к стабильности иммобилизованного фермента,Весовое соотношение окисленныйсферический карбонит: четыреххлористый титан можно варьировать от 1:0,2до 1:0,5, дальнейшее увеличение количества четыреххлористого титана(табл, 1) уменьшает активность уреазы. Это, по-видимому, связано с ухудшением адсорбционных свойств носителя по отношению к выделяющимся в ходереакции ионам аммония, что ингибирует иммобилизованную уреазу,Иммобилизованная указанным способом уреаза при хранении при 5 С втечение 1 мес, сохраняет 80 исходной активности, При использовании вреакторе периодического действия(13 раз) сохранялось 60 исходнойактивности, рН оптимум иммобилизованной уреазы 8,5, а температурный оптимум 50 С. Отмечено существенное увеличение термостабильности, При 70 Ссохраняется 56 исходной активностииммобилизованной уреазы, тогда какнативная в этих условиях полностьюинактивируется, Стабильность препарата выше, чем при иммобилизации поизвестному способу (табл. 2) . Прииммобилизации предлагаемым способом сохраняется 44 исходнойудельной активности, а связывается30 белка, При иммобилизации по известному способу сохранение удельнойактивности уреазы значительно ниже(табл, 3) .П р и м е р 1 . 2 г окисленного сферического карбонита суспендируют в 5 мл воды, по каплям при интенсивном перемешивании прибавляют 0,5 г четыреххлористого титана, процолжают.Соотношение угляАктивность имьобилии четыреххлористо- зованной уреазы,го титана от максимальной Процент связывания белка (от максимального) при иммобилизации уреазыЧ 1;0,05 80 42 80 63 1:0,2 98 97 1:0,3 1:0,4 1:0,5 1:0,6 98 100 100 100 100 100 1:0,7 50 93 перемешивание 1 ч, Носитель многократно промывают дистиллированной . водой. Аналогично получают носитель, обработанный 0,2 г четыреххлористого титана. К 800 мг полученного таким образом угля добавляют раствор 10 мг уреазы в 10 мл фосфатного буфера, рН 7,6 (энзиматическая активность 34 ед/мг препарата), За единицу уреазной активности принимается такое количество фермента, в резуль тате реакции которого с субстратом выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 мин нри 30 С, Полученную смесь перемеошивают 4 ч при. комнатной температуре. Затем методом декантации промы вают фосфатным буфером рН 7, 6 1 М раствором КС 1 и дистиллированной водой. Получают препарат иммобилизованной уреазы с активностью 55,9 ед/г носителя, что соответствует 44-му О сохранениюисходной удельной активности при 30-ом связывании белка.П р и м е р 2 . 2 г окисленного фенолформальдегидного угля суспендируют в 5 мл воды, по каплям при интенсивном перемешивании прибавляют 0,5 г четыреххлористого титана, продолжают перемешивание 1 ч. Носитель многократно промывают дистиллированной водой.К 800 мг полученного таким образом модифицированного окисленного фенол.Формальдегидного угля, добавляют раствор 10 мг уреазы в 10 мл фосфат ного буфера рН 7,6 (экзиматическая активность 34 ед/мг препарата) .Аналогично примеру 1 получают препарат иммобилизованной уреазы с активностью 51,3 ед/г носителя, что соответствует 40,4-му сохранению исходной удельной активности при 30-ом связывании белка.Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет получить стабильные препараты иммобилизован. ной уреаэы с более высокой удельной активностью, отличающиеся значительной термостабильностью при .повышенной температуре, способные к многоразовому использованию,Использование предлагаемых окисленных углей (окисленного сферического карбонита и окисленного фенолформальдегидного угля) позволяет исключить запыленность форменных элементов крови, что особенно важно лпянормального функционирования аппарата фискусственная почка и позволяет испольэовать иммобилизованнуюуреаэу в медицине,Замена дефицитных и дорогих сшивающих реагентов на четыреххлористый титан значительно удешевляет получение целевого продукта,1090715 Таблица 2 Потери исходной Сшивающий реагент активности Моча 5 л Раствор мо- Плазма крочевины ви 5 л1,5-ный5 л 65 80 100 50 СКНо 70. 100 55 ФАУ 80 100 70 100 70 27 14 20 26 65 42 16,ФАУо Рагсой35 55. 80 20П р и м е ч а н и е . СКНь - окисленный сферический карбонит; ФАУр - окисленный фенолоформальдегидный уголь; Оагсо ймарка угля. Таблица 3 Сшивающий реагент Сохранение исходной активности,ф Уголь 25 1-Циклогексил-(2-морфолиноэтил)карбодиимид (известный) СКН 15 ФАУо Рагсо й20 15 СКНо Дициклогексилкарбодиимид (известный) 10 ФАуо 13 Эагсо 6-60 44 СКНо Четыреххлористыйтитан (предлагаемыйспособ) 40,4 Составитель В,МуронецРедактор Н.Джуган Техред Т.Маточка Корректор О,Билак Заказ 3015/23 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5