Способ определения адгезивных свойств бактерий

Л 076441 Ц 6 Р;С 12 К 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНн двтаддномм свщатвъдтви 1 1огонный аа 1 п 8,1 азшагосуСез365 372 ГОСХЦАРСТЮЕННЫЙ КОМИТЕТ ОССРГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(22) 22;02.82 (46) 28,02.84.баюл. Р 8 (72) В.И.Брилис, Т.А.Бриле Х.П.Ленцнер и А,А.Ленцнер (71) Тартуский ордена Труд Красного Знамени государстуниверситет (53) 615375 (088.8)1(56)ЪВапа М., Капапе У., Вгей 1 У, А 6 Ьегепсе оГ Мусс.ЕпГесЪ. Ешшцп.1978, 21, 2,(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ путем смешивания эритроцитоь человека и микроорганизмов с последующими инкуба- . цией, отмыванием неприкрепившихся клеток и определением адгезиэуых свойств, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения и повы-шения точности способа, используют эритроциты хозяина, при этом их . смешивают с микроорганизмами в соотношении 1 г 10 и инкубирование ве 1 дут при встряхивании.Изобретение относится к медицине, преимущественно к Микробиологии,и может быть использовано прн определении болеэнетворности микроорганизмов и механизмов инфекции.Известен способ определения адгезивных свойств бактерий путем изучения адгезии микоплазм на нативныхэритроцитах Г 13.Однако этот способ обладает недостаточной точностью н являетсятрудоемким при выполненииЦель изобретения - упрощение иповышение точности способа.Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа определения адгезивных свойств бактерийпутем смешивания эритроцитов человека и микроорганизмов с последующимиинкубацией, отмыванием неприкрепившихся клеток и определением адге"зивных свойств используют эритроцитыхозяина, при этом их смешивают смикроорганизмами в сботнсшении1:10 и инкубирование ведут привстряхивании.Способ выполняется следующим образом.Микроорганизмы предварительносмешивают с эритроцитами хозяина в,0,5 М растворе трисбуфера, инкубиру"ют при 35-37 фС во влажной камерев течение 25-30 мин, высушивают,.Фиксируют, окрашивают и после оценкипод световым микроскопом отбираютнеобходимые штаммы бактерий, которыепосле отмывания смешивают с эритро-.цитами в концентрациях соответствен-но 1 млрд/мл и 100 мпн/мл, затемСмеоь инкубируют при 35-37 С навстряхивателе в течение 25-30 мини после высушивания, Фиксированияи окрашивания производят под .световым микроскопом окончательную оценку адгезии.П р и м е р, 1 этап - предвари 1тельный опыт, Предназначен длябыстрого определения адгезивныхсвойств большого числа штаммов бактерий.Буферный раствор. Во всех опытахиспользуют 0,05 М раствор трисбуфера,приготовленный на 0,87 М растворехлористого натрия.Взвесь бактерий. Односуточныекультуры микробов, хорошо растущихна скошенном агаре или какой-либодругой питательной средесмывают2,0 мп буферного раствора рН 7,27,3 при 37 С,Взвесь эритроцитов. Кровь из локтевой вены берут в пробирку с гепарином: одна капля гепарина на 5 мл крови. Эритроциты дважды отмывают буферным раствором рН 7,2-7,3 при 37 С на центрифуге (300 об/мин) Готовят взвесь эритроцитов на указанном буфере концентрацией1 млрд/мл.Постановка опыта. На необезжиренное предметное стекло наносят од ну каплю буферного раствора рН 7,2-5 7,3 при 37 фС, в которую суспендиру.ют по одной петле взвесей бактерийи эрнтроцитов. На одном предметномстекле можно одновременно ставитьдо пяти опытов. Предметное стекло 10 помещают во влажную камеру на 30 минпри 37 фС, затем высушивают на воздухе, Фиксируют метанолом 10 мин,окрашивают по Граму. Для полученияболее контрастных препаратов при ра боте с грамположительными микробамиокрашиванне кристалвиолетом продолжают 45 с, раствор Люголя выдерживают 30 с, обесцвечивают спиртом1 мин и докрашивают фуксином Пфейфера 2 мин с грамотрицательными микробами соответствующее время - 2 и1 мин, 15 и 30 с, Изучение адгезииведется под световым микроскопом,а оценка-адгезивных свойств прово дится с помощью трех показателейС, Т .и О, высчитываемых на 25 эри-.троцитах.С " среднее количество микробов,прйкрепившихся к одному эритроциту.Т - наличие направленности (такси- ЗО са )микробов к эритроцитам 0 - нет(неприкрепившиеся бактерии более илименее равномерно разбросаны междуэритроцитами), 1 - слабый таксис(менее половины неприкрепившихся 35 бактерий располагаются вокруг эритроцитов), 2 - сальный таксис (подавляющее большинство неприкрепившихсябактерий располагаютсж вокруг вритроцитов), О - занятость окружности 4 О эритроцита прикрепившимися микробами: 0 - прикрепления нет или на единичных эритроцитах единичные микробы 1 - занято до 1/4, 2 - до 1/2,3 - до 3/4, 4 - более 3/4 окружности 45 большинства эритроцитов.Дпя микробов, плохо растущих натвердой питательной среде (напримерлактобациллы) используют жидкую питательную среду. На предметное стекло наносят каплю, буферного растворакоторый после смешивания с однойпетлей микробов в питательной среде и одной петлей взвеси эритроцитов обеспечивает рН 7,1-7,3,.(пределы, в которых эритроциты со храняют йормальную Форму ).1 этап дает предварительное представление об адгезивных свойствахбактерий.1 Е этап - основной сЪыт. Предна эначен для более точного определенияадгезивных свойств бактерий, выяснения,влияния свойств клеток микрои макроорганиэма на процесс адвезии.Взвесь бактерий. Односуточную 65 культуру на плотной или в жидкой пи.риме тательной среде дважды п-омывают раствором 0,05 М трисбуфера рН 7,2- 7,3 при 37 С на центрифуге (1500 об/мин), Готовят взвесь микробов концентрацией 1 млрд/мл на указанном буферном растворе.Взвесь эритроцитов. Готовят аналогично предварительному опыту, только концентрация эритроцитов 100 млн/мл.Постановка опыта. В пробирку вносят равные объемы (0,25-0,5 мл) взвесей микробов и эритроцитов, инкубируют при 37 С на встряхивателе 30 мин. Затем на тщательно обезжирей ном предметном стекле готовят мазок, который обрабатывают аналогич. но таковому в предварительном опыте. При оценке адгез.ивных свойств микробов используют показатели С Т и О, причем подсчет ведется на 100 эритроцитов, Кроме них определяют пока-. затель К - процентное содержание эритроцитов, имеющих на своей поверхности микробы, по отношению ковсем изученным эритроцитам.Дпя изучения влияния микроорганизма на адгезию следует ставить параллельные опыты с эритроцитами различных людей и (или) животньпс.11 этап дает представление об адгезивных свойствах бактерий, о влиянии на процесс адгезии свойствклеток микро- и макроорганиэма.Споооб отличается от аналогови прототипа простотой и доступностью, возможностью изучения одно временно большого числа штаммовбактерий и клеток от различных людей и животных, получением количественной характеристики адгезни,позволяет одновременно изучить влия ние на адгезию свойств клеток микро- и макроорганизма.Оригинальность способа состоитв выборе модели, где для изученияадгезивных свойств микроорганизма 35 используют эритроциты хозяина - носителя данного штамма. Концентрациямикроорганизмов и эритроцитов 10:1в отличие.от общепринятой 1000:1,кроме того, .не проводят отмываниянеприкрепившихся микробов. Отличается и оценка адгезии в способе.Адгезивность и процент вариациирезультатов опытов при различныхсоотношениях эритроцитов и лактоба:- цилл приведены в таблицеВариациярезультатов опытов у высокоадгеэивных штаммов при соотношении 1:100в среднем 10,5, а при 1 г 10 - 5,0,у среднеадгезивных 12,1 и 8,0, ау низко- и неадгезивных - 15,6 и11,6 соответственно.1076441 Составитель П.БонарцевТехред О.Веце Корректор С.Шекмар Редактор Е.Папп ЮЕВ 4 ВЗаказ 650/22 . Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Таким образом, использование пред,лагаемого способа приводит к достовернощ увеличенив точности опытов 1 Р а,0,01 ) в 2 раза. Изменение соотношЕния микробов 5и зритроцитов также значительно упрощает исследования. Отпадас т необходимость использования различных способов отмывания неприкрепившихся микробнык клеток, увеличивается воэможность изучения большого числа штаммов бактерий, сокращается время исследования.