Способ определения принадлежности антител к классу иммуноглобулинов

Изобретение относится к медицине,в частности к общей и прикладнойиммунологии.Известен способ определения антител в сыворотке крови путем предварительной адсорбии антител спЕцифическим .антигеном с последующей постановкой реакции гемагглютинации,по снижению титра антител определяютналичие антител в исследуемой сыворотке 1)Однако способ недостаточно точендля определения принадлежности антител к классу иммуноглобулиновИзвестен способ определения при"надлежности антител к классу иммуцоглобулинов, включающий добавлениеантигенного эритроцитарного диагностикума к исследуемой сыворотке споследующим добавлением антисыворотки к иммуноглобулинам определенного класса (2) .Однако известный способ .недостаточно специфичен,Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа.Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа, включающего добавление антигенного эритроцитарного диагностикума к исследуемой сыворотке, антигенный эритроцитарный диагностикум добавляют после предварительной обработки исследуемой сыворотки антиглобулиновыми сыворотками, прогретыми в течение;15 мин при 75 С.Способ осуществляется следующимобразом.делают четыре одинаковых рядапоследовательных разведений исследуемой сыворотки. Во все лунки первого ряда вносит равный или двойной(В .микротитраторах ) объем антиАсыворотки, во все лунки второго ряда - антисыворотки, в третийряд - антиМ сыворотки и в четвертый - 0,8 БЪ-й раствор БаСХ (контрольный ряд). После 30-40-минутной экспозиции во все лунки добавляют эритроцитарный антигенный диагностикум., Вносимые антиглобулиновыесыворотки связывают иммуноглобулины соответствующего класса в исследуемой сыворотке. Следовательно,задержку или полное отсутствие агглютинации диагностикума в одном иэтрех рядов по сравнению с контролеми двумя остальными рядами, содержащими антиглобулиновые сыворотки,указывает на принадлежность определяемых в исследуемой сывороткеантител к иммуноглобулинам именноэтого класса. П р и м е р, С помощью предлагаемого способа и реакции Кумбса исследовали сыворотки больных дизен" терией (специфичности Зонне) в стадии острого и хронического заболевания.По предлагаемому способу готовили по четыре одинаковых ряда иссле дуемых сывороток с разведения 1:10в объеме 0025 мл (1 капля) и добавляли по 0,05 мл во все лункипервых рядов предварительно прогре"тую при 75 фС в течение 15 мин раз веденную 1;10 кроличью сывороткупротив иммуноглобулинов класса А,.во все лунки вторых рядов - такжеобработанную кроличью сывороткупротив иммуноглобулинов класса С, 15 во все лунки третьих рядов - противиммуноглобулинов класса М. В четвертые ряды вносили по 2 капли0,85-го раствора ВаС 1. После 40-минутной экспозиции во все лунки разр 0 ведений исследуемых сывороток добавляли по 1 капле (0,025 мл ) антигенного эритроцитарного диагностйкумаЗонне, Учет реакции проводили через 1,5 ч. Полученные результаты от ражены в табл. 1 и 2.По значительному снижению титраРПГА в результате предварительнойобработки сыворотки больного острой дизентерией анти;1 М сывороткой(в 8 ра) или сыворотки хронического больного антисывороткой (в4 раза ) по сравнению с контролем слеследует отнести определяемые антитела в одном случае к 1 М, а в другом - к 10, Результаты реакцииКумбса при обследовании сывороткиострого больного совпадают с даннымипредлагаемого способа, а при обследовании сыворотки хронического больного оказались отрицательными.40Предлагаемый способ являетсячувствительной (результативной) реакцией обнаружения специфическихантител определенного класса им. муноглобулинов, что важно в диференциальной диагностике хроническогои острого заболевания.Повышение температуры прогреванияантиглобулиновой сыворотки предназначено для повышения специфичности 50 нейтрализации определенного классаантител в исследуемой сыворотке,за счет разрушения инактивации1 ф. в .антител в антисыворотке. Известн 8, что неспицифические результаты, 55 в основном связаны с антителами 1 М.В табл. 3 приведены данные опреде.ления принадлежности антител к классу нммуноглобулинов по предлагаемому способу с использованием прогре тых в разных условиях и непрогретых антисывороток.Как видно, непрогретые или недостаточно прогретые антиглобулиновыесыворотки неспицифически нейтрали зуют антитела и других классов, что1074531 разведениях, где отмечены отрицательные результаты РПГА для предот" .вращения спонтанной агглютинации диагностикума). Это обстоятельство значительно снижает диагностические 5 воэможности (разрешающую способностьизвестного метоДа, так как в такихразведениях исследуемой сывороткиможет оказаться слишком мало антител, присоединившихся к диагностику му. Кроме того, известный метод поз.воляет определять антитела толькоодного класса (имеющих наибольшийтитр), По предлагаемому способувозможно определение антител одно временно нескольких классов, Пре"имуществом предлагаемого способаявляется также то, что он значительно более прост в исполнении и позволяет получать результаты в 27.20 2,5 раза быстрее, чем известный. Таблица 1 Результаты реакций с сыворотками больных Способ ю 1 ююююеюавюе Острой дизентерией Хронической дизентерией анти- анти,1 А 10 0,85-йМаС 1 нти,85-йаС 1 анти 1 и анти- анти 1 А 1 Р Отри- Отри цатель-цатель ный ный:1201 ф 30 20 1 ф 1 г 32 а н и ег разведение исследуесодержало антитела 1умо;фф титр РПГА с исследуботки антиглобулиновымираствором ИаС 1. мой сыворотки, которое еще М, адсорбируемые диагносты П р затрудняет трактовку результатов. Только инактивация 1 И-антител в определенных режимах обработки антиглобулиновой сыворотки позволяет четко определять принадлежность антител к определенному классу в исследуемой сывороткеДальнейшее повышение температуры прогревания .выше 75 фС) .инактивирует в антиглобулиновой сыворотке антитела всех классов, что делает невозможным осуществление способа.Таким образом, предлагаемый спО- соб благодаря использованию прогретых антиглобулиновых сывороток позво. ляет с большой раэрешакщей способностью определять принадлежность антител в широком диапазоне разведений исследуемой сыворотки к иммуноглобулинам любого класса, в то время как по известному способу определение антител провоцят лишь в РеакцияКумбса Отри- Отрицатель- цательный ный ой сывороткой после обрасыворотками или 0,85-м1074531 антиГМ Таблица 2 Результаты РПГА с сыворотками больных, предварительнообработанных по предлагаемому способу3 Антигенный эритроцитарный диагностикум специ- фичности 0,85%-м раствором яас 1 антир анти-.1 А 09,12 120 1;320 1 з 320 0111 В 41 а ИО 11401 й 320 1 ф 160 1:140 1:140 Таблица 3 тТитр РПГА с антигенным диагностикумом специфичности Зонне в зависимости от. Условий прогревания антисывороток Антисы- воротка 75 С 80 С 70 оС без про- гревания 15 мин 30 мин 15 мин 30 ьщн 15 мин 30 мин 1 з 160 1;160 1 з 200 1:200 1:200 1200 Анти 1:140 1:200 1;200 1 з 200 1 ф 80 1 з 50 1 з 40 180 1 з 120 1 у 140 1 з 200 1200 1 з 200 1200 1 з 120 1 ф 200 1 с 200 1 з 200 1200 1 г 200 1 ф 200 1 г 200 П р и м е ч а н и е: Исследовайия проведены на сыворотке больного дизентерией Зонне, острая стадия болезни. Составитель Г.КрюковаРедактор О.РрковецкаяТехред М,Гергель Корректор А,ильин Заказ 419/6 Тираж 688Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб.,д.4/5