Способ определения гуморального иммунитета

(19 (И) 60 А 61 К 39/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГП ЗОБРЕТЕНИ ЕЛЫТВУ ОПИСАНИЕН ДВТОРСНОМУ СВИДЕ 9 7 й и И.В.Ло медицински ег 1 соЬа Е,оГ 1 ецсосуеешеп 1 сопоцш-1959 14у акоп ошр оц" СССР73.кие детельство К 39/00, 1 Иммунологиче1979, с.38 2.(56) 1. СЬцйоше 1 7ЫЬацвЫу 8, ПеесФап 1 ЬоИез Ьу 1 Ье, сРФоп 1 ееС. - фВ 1 о920-930.2. Авторское св9 395086, кл. А 613. Фримель Х.методы. М "Мир",(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РУМО РАЛЬНОГО ИИИУНИТЕТА путем выявле" ния антигенов в сыворотке крови с помощью фотометрии, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, одновременно дополнительно выявляют в сыворотке крови содераание антител и комплемента в единицах активности комплемента по СН 50.Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунологическим способам диагностики, в частности к способам определения гуморального иммунитета, и в особенности может применяться для оценки такого иммунитета при наблюдении за,состоянием, развитием и течением заболевания человека и животных с чертами аутоиммунного процесса, например ревматических заболеваний хронических заболеваний легких, хронических реакций отторже ний трансплантата. "Известны способы определения гу" моральногоиммунитета, состоящие в раздельном определении активности комплемента и антител по уеакции потребления комплемента 1 и 21 .Недостатком способов является приблизительное и неточное определение содержания антител, так как оно базируется на визуальном учете частичного гемолиза эритроцитов ба, рава или 100-го гемолиза эритроцитов в гемолитической системе, реа;, гирующей с комплементом, несвязан-. ным,антиген-антителом. Кроме того, способы не предполагают одновременное определение уровня антител и активности комплемента, Недостатком способов явдяется также то, что содержание антител выражают в процентах разности степени гемолиэа, которую оценивают визуально в контрольных и опытных пробах, или. Условных обозначениях типа "+" и . Указанные недостатки не позволяют одновременнообъективно судить о степени взаимЬсвязанных ком понентов единой иммунологической реакции а именно антител, антигена и комплемента, на их определенйе затрачивается много времени.Известен также способ иммунохимического определения антигенов с помощью фотометрии 3 .Однако известнйй способ пОэвОДяет определить только один участник .гуморальной реакции, а именно антиген в условных единицах экстинции. Целью изобретения является повышение точности и ускорения способа.Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа путем выявления антигенов в сыворотке крови с помощью Фотометрии одновременно дополнительно выявляют в сыворотке крови содержание антител и комплемента в единицах активности комплемента по СН 50.Способ осуществляется следующим образом.В три пробирки наливают по 0,1 мл исследуемой сыворотки. Первую из них используют для определения комплемента, вторую и третью - для опреде-ления антител и антигена. Во вторую.пробирку прибавляют 0,1 мл тканевогоантигена, доведенного по белку до 5 концентрации не менее 1 г/л, втретью " 0,1 мл антисыворотки к ис".следуемому антигену с титром антител в РСЕ в пределах 1;400-1:6.00.Антиген и .антисыворотка должны быть 10 проверены на комплементарность, антикомплементарность и гемотоксические свойства, В каждую из пробирок доливают до 1,0 мл веронал-мединаповый буфер (рН 7,3) и помещают 15 в термостат при 37 ОС,на 45 мин. Через каждые 15 мин пробы встряхивают.Содержимое каждой пробйрки делят начетыре порции по 0,1, 0,2, 0,3 и0,4 мл, после чего каждую из порций 2 О доводят веронал-мединаловым буферомдо объема 0,5 мл и таким образомполучают разведения исследуемой сыворотки в соотношениях 1:100, 1:50,1:37, 5 и 1:25 разведения подобраны 25 таким образом, что именно в этих разведениях происходит не более чем50-й гемолиз сенсибилизированныхэритроцитов барана) . Затем в каждуюиз полученных проб прибавляют по0,5 мл стандартизированной ФотометЗо рическим способом 4-й взвеси бараньих эритроцитов с коэффйциентом. экс-.тинции 0,86+0,01.Полученную гемолити- .ческую смесь перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 С, затем охлаждаЗ 5 ют до 18"20 фС комнатной температуры)центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. В аналогичных условияхпроводят контрольные пробы с 0,5 млверонал-мединалового буФера и 0,5 мл 40 сенсибилизированных эритроцитов барана для исключения спонтанного гемолиза. Для колориметрирования берутпробы с частичным гемолизом иколориметрируют при синем светофильтре в 45 кювете 3,0. Серию проб для определения комплемента колориметрируют первой и определяют общую комплементарную активность сыворотки крови вединицах активности комплемента по 5 О СН 50, соотнося показатели ФЭК состепенью гемолиза эритроцитов баранапо стандартной шкале гемолиза. Затем по величине экстинции, соответствующей определенному проценту гемолиза, получают активность комплемента в стандартных единицах в 1 мл сыворотки крови. Затем колориметрируютпробы, обработанные антигеном и антисывороткой, и по результатам колориметрии пересчитывают содержание ан тигена и антиген в 1 мл сывороткиП р и м е р. При колориметриипроб сыворотки из разведения первойпробирки (определение комплемента)получены показатели ФЭК:0,17 - враэ веде нии 1: 100; О, 29 - в раэ ведении 1: 5 О; О, 34 - в разведении 1: 37,5,О,39 - в разведении 1:25, что соответствует 30, 60, 70 и 90 гемолиза.Таким образом, в Расчет принимаютсярезультаты колориметрии разведения, 5где гемолиз не превышает .50, т,е.в примере это разведевие 1:100. Иэтаблицы соотношений степени гемоЛиза и активности комплемента по .СН 50 находят, что активность комплемента в разведении сыворотки 1:100 равна 0,84 ЕД по СН 50, т.е.активность комплемента нативнойсыворотки 0,84 х 100=84. ЕД.При кэлориметрии сыворотки обработанной антигеном (определение аНтител), получены показания ФЭК:0,12в разведении 1:100 ф, 0,23 - в разведении 1:50, 0,30 - в разведении 1:1 г 37,5, 0,55 - в разведении 1:25,что соответствует. 20, 45, 60 и 70гемолиза. В расчет принимаются разведения 1:100 и 1:50, что соответствует активности комплемента 0,76и 0,48 ЕД или на 1 мл нативной сыворотки 76 и 48 ЕД, или усредненно.76+48=124, 124:2-62 ЕД. Зычтя величину затраты комплемента после обработки сыворотки антигеном т.е.связывания комплемента комплексомантиген-.антитело) из общего содержания комплемента, получают величинусодержания комплемента, соответствующую концентрации (содержаник) антител. При этом содержание антител выражают в той же разности - активнос. ти комплемента по СН 50. В примереэто 8462=22 ЕД.При колориметрии сыворотки, обработанной антисывороткой против антигена .определение антигена, получены показания ФЗК: 0,15 - в разведении 1:100, О,.27 - в разведении Ь 50,0,32 - в разведении 1;50, 0,32 - в; раэведении 1,37.,5 и 0,36 - в разведении.1.25, что соответствует 25, . 4555, .70 и 80 гемолиза, В расчетдрйн 1 мают разведение 1 г 100, чтр со"ответствует 0,8 ЕД или на 1 мл натинной сыворотки 80 ЕД. Разница между активностью общего комплемента 5 Ои его затратой поеле реакции с антисывороткой отражает содержание циркулирующего антигена в той же размерности - активности комплементапо СН 50 В примере это 84-.80=4 ЕД 55. По предлагаемому способу выполйе. но обследование 132 больных ишими- .60ческой болезнью сердца. Исследованмиокардиальный антиген и антителак нему, а также антитела к. антигену атеросклеротически измененной,интимы .аоРты и ткани щитовидной же леэы. Установлена высокая точность способа по оценке аутоиммунного про - цесса как в стадии появления анти- гена, так и в стадии образования антител, что позволяет вести строго дифференцированную по времени й. интенсивности иммуномодулирующую терапию или обоснованно воздерживаться от нее.. Содержание аутоантител к мйОкардиальному антигену в одинаковых свт риях сывороток приведено в табл, 1.Как видно иэ табл, 1, для серйй сывороток 5,6,7 и 12 определение аутоантител по изв. спосббу невозможно, несмотря на их наличие.Сравнительные данные предлагаемого известных способов приведены в табл, 2.:Таким образом, предлагаемый способ. позволяет более точно (на 40) . и в более короткий срок в единой системе учета единицах активности комплемента) одновременно определять все факторы гуморального ймт мунитета: комплементы, антиген и антитела.Т а б л й ц а 1В твювтютюювеевюю ввеютеввювв Содержание по способу ттвтвтевююте юевевютююввтюю.Таблица 2 Способ ПредлагаАГ,АТ,С 0,05-0,1 45 мин По СН 50 0,1 0,05-0,1 45 мин 0,2 0,05-0,1 90 мин 1,0 йТ 18-24 ч и+н анв титре йТ или АГ . 0,1 0,2 РСК Известныйй3 ЕД экстин,25-0,5ции 3-20 60 мин П р и м е ч а и и е: АГ - антиген, АТ - антитела, С - комплемент; фф Количество определяемого вещества в мкг/мл азота антител. Составитель Г.КрюковаРЕдактор О.Юрковецкая Техред А.Бабинец Корректор А,Ильин Заказ 419/6Тираж б 88 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная,4 Известный 2 Из вестный 1 ОпределяемыекомпонентыАГ, АТ, Сф Чувствитель ностьспособа,мкг/млазотафф Время,затраченное на выполнениеспособа Единицыучета ко-.нечного результатареакции Количествосывороткина однупробу,. мл.