Способ получения -галактозидазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХ,СОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИН 0% (10 ЕТЕНИ АТЕН итании3/10, опублик 625,кл.195-11,554;к. 1978,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ ОПИСАНИЕ ИЗ(56) 1. Заявка ВеликобВ 1450487, кл, С 12 Э1976,2, Патент США У 364опублик. 1972.3. Патент СССР В 60кл. С 12 Н 9/40, опубл Бюл. У 16Витобелло, Паоло БранЧимини (1 талия) нте Национале ИдрокарС 12 0 9/40; С 12 К 1/85(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ о 6 -ГАЛАКТО"ЗИДАЗЫ, предусматривающий культивирование его продуцентов на питательнойсреде, содержащей источники углерода,азота и минеральные соли в присутствии одного из 12 сахаров в количестве 0,5-1,0% от массы среды при опти.мальной температуре н рН процесса споследующим отделением биомассы кле-,ток, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения активности иускорения процесса, в качестве продуцентов используют штаммы микроорганйзмов Басс 11 огошусея сегечяда 1 айагоеасеия ИККИ 12056 или БассЬогошусеясегешяа айаг оеа 8 хпояця ИКАЛ 12057,+ + 8. сегечз.- вюа 3 чаг. о 1 еассцвГлюкозаГалактозаМальтозаТреалоэаМелибиозаРафинозаД-МаннитД-ГлюцитолЭта нолГлицеринДЬ-молочнаякислота Изобретение относится к микробиологической промьппленкости, а именно кспособу получения оС -галактоэиазы,используемой для гидролиза рафинозы,Известен способ получения оС -галак тозидазы, согласно которому оС -галактоэидазу получают культивированиемплесени РепсПИцш йцропй (Таагошусев 1 ЬегшорМ 1 цз) в водной среде,содержащей Ъ 1 сахар с Ф 1 а -0-галактопиранозильной связью и последую.щим,отделением мицелия. Культивиро.вание проводят в водной суспензии,полученной при обваривании незреаых.стручков фасоли 111. 15Известно также использование препарата а -галактозидаэы, полученнойиз мицелия Могг 1 егейа ч 1 пасса чаггаНхповецгЩхег (АТСС В 20034),несодержащего инвертазы, обеспечивающего понижение рафинозы и увеличение сахаровы в свекольной патоке 1.21.Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ получения о -галакто"зидазы, предусматривающий культивирование его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли вприсутствии одного из 12 сахаров в ко"личестве 0,5-1,03 от массы. среды при 30оптимальной температуре и рН процесса с последующим определением био:массы клеток, Активность ос -галактозидазы иа сухой основе составляет1,49710 ед/г Г 33,Однако известные способы характеризуются недостаточно высокойскоростьюбиосинтеэа фермента и его активностью. Цель изобретения - повышение ак 40 тивности и ускорения процесса.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения аС -галактозидазы, предусматривающему культивирование его продуцентов на пи 45 тательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в присутствии одного из 12 сахаров в количестве 0,5-1,0 Е от массы среды при оптимальной температуре и рН процесса с последующим отделе 50 нием биомассы клеток в качестве про" дуцентов используют штаммы микроорганизмов ЗассЬогошусев сегечдва 1 чаг о 1 еасецв ЯВЯМ 7 12056 или ЗассЬогошусез сегечва 2 чаг о 1 еаЗповцв НЮИ, У 12057.Используемые микроорганизмы выделены из отбросного щелока обработки маслин на отжимном прессе, имприсвоили соответственно номера:НВКТ. 7 12056 и ШЮ. Т 12057.Ниже представлены характеристикивыращивания этих микроорганизмов,их физиологические и формологическиесвойства.А, Характеристики выращивания.1. Твердая среда (3 дня). Мальтовый агар. Колонии, маслянистые, кремового цвета и блестящие.2. Жидкая среда (3 дня). Мальтовый экстракт. Образуется осадок (в8 сегечхва 1, чаг оМеаЗьповцв наблю"дается слабое кольцо).,В. Морфологические свойства.1. Характеристики вегетативныхклеток. Клетки эллипсоидальные,цилиндрические и иногда удлиненные,2. Образование псевдомицелия илиистинного мицелия. Зачаточный псевдомицелий присутствует в анаэробньиусловиях.С. Половые характеристики. Вегетативные клетки превращаются непосред.ственно в которые содержат от однойдо четырех сфвроидальных спор.Д. Физиологические свойства.1. Использование источников углерода.Ферментация З.сегечд- З.сегеч- зда 1 чаг. вай.чаг.о 3 еассцв ойа 81 повцв+; + Другие углеродные соединения не ас симилйруются.2. Ассимиляция, азотистых соединений.Нитрат калия негативный,3. Рост при 37 С позитивный.,фДля классификации руководствуютсясхемой, описанной автором: 1.Р. 7 аайег Ма 1 г в кн. "3 Ье.еаза" 2"е изда-;ние под ред. 1, Ьоййег.Культуры предлагаемый штаммов,могут быть пригртовлены в аэробныхусловиях любым известным способом, например путем поверхностного разведе Ония или при погружении выращиваемыхкультур с использованием ферменторас мешалкой.Питательная среда для разведения,которая может быть либо твердой, либо 15жидкой, содержит источник ассимилируемого углерода, источник азота и минеральные соли.В качестве источника углерода можно использовать глюкозу, мелибиозу, 20рафинозу и другие сахара, глицерини ацетат натрия.В, качестве источников азота можноиспользовать неорганические и органические азотистые соединения, такие 25как мясной экстракт, дрожжевой экстракт, пелтон, триптон, продукты гид ролиза казенка в аминокислотных средах, соевую мукуи соли аммония. Крометого, при разведении этих микроорга- З 0низмов на глюкозе, образуется фермент(вн),во 1 40Велйчина рН питательной среды для разведения находится в пределах от 4 до 7 и предпочтительно от 5, 0 до 5,5, температура питательной средыосоставляет от 20 до 40 С предпоч 451тительно от 25 до 28 С.Образование фермента может быть ускорено путем добавления небольших количеств мелибиозы, которая является дисахаридом, полученным в результате частичного гидролиза рафи- нозы. Мелиобиоза может вводиться непосредственно в питательную среду для выращивания перед инокулумом или же, когда стадия логарифмического роста 55 завершена. Индукционный период может колебаться в пределах от 16 до 72 ч и находиться в пределах от 40 до 48 ч. Клетки, скапливаемые в ходе процесса брожения или после завершения брожения, могут использоваться как таковые или в ниде высушенного порошка. Наряду с этим могут использоваться сырые или очищенные экстракты таких клетокКлетки разделяются любым известным способом, при этом используется сырой или очищенный содержащий ферментэкстрактДальнейшее как техническое, так и экономическое преимущество может быть достигнуто фиксацией фермента посредством смешивания его с макро- молекулярными соединениями посредством образования химических связей с основным телом или посредством ионного связывания, а также путем физи-, ческой фиксации фермента или клеток.Получаемые таким образом клетки вводятся как таковые или лишенные подвижности в реакционную среду, содержащую мелассу, имеющую величину рН в пределах от 4 до 7, температурао которой составляет от 30 до 60 С. Рафиноза, которая содержится в мелассе, в результате гидролизуется до, образования галактозы и сахарозы, причем выход последней повышается.П р и м е р 1. Приготавливаютпитательный бульон для выращивания,имеющий следующий состав воды, г/л:(вн), 80 5МяЗО 7 Н О 5Ва НРО 12 Н, О 4,6кн РО 3НаСХ 0,1СаС 12 0,05Дрожжевой экстракт 10МелибиозаФ 10 Эти соединения растворяют в деионизированной воде и подкисляют соляной кислотой до достижения величины рН, равной 3,5. Приготовленный таким образом питательный раствор распределяют по широкогорлым колбам Эрленнейера емкостями 500 мл (по 100 мл питательного раствора на колбу стериоЭ лизация колб при 116 С в течение 30 мин), Содержимое колб инокулируют 1 мл культуры штамма БассЬагошусез сегечз.ахами,чаг оеасецз в 250-милли- митровых колбах, содержащих 50 мл указанного питательного раствора, микроорганизмы выращивают лри 25 С в течение 16 ч при перемешивании1090262 3мешалкой, вращающейся со скоростью.180 об/мин,Колбы для брожения помещают в инкубационные условия, где происходитперемешивание (со скоростью вращения 180 об/мин) при 25 С,После 40 ч с момента инокулирования клетки культуры питательногораствора (бульонной культуры) собирают путем центрифугирования и промы,вают фосфатным буферным раствором(О, 1 М, рН = 5,6). Из 100 мл питательного раствора (бульона) получают0,55 г высушенных клеток.Влажные клетки, выделенные из15100 мл питательного раствора, повтор-.но суспензируются в 100 мл фосфатногобуферного раствора (0,1 моль, рН =5,6) и определяют ферментативнуюактивность, Один грамм высушенныхклеток содержит примерно 1 ф 10 фер 7ментных единиц. Ферментативная активность измеряют следующим образом.К 1 мл содержащей буфер клеточной суспензии, добавляют 4 мл фосфатного буферного раствора (О, 1 М; рН =5,6) и несколько капель толуола дляразрыва клеточных перегородок. После15 мин инкубирования с перемешиваОнием при 40 С в суспензию добавляют ЗО10 мл 1 Е-ного раствора (вес/об) мели"биоэы в фосфатном буферном растворе(0,1 И; рН = 5,6), Реакция инкубируется при 40 С в течение 2 ч в перемешиваемой водяной бане и прекращает- Зся путем кипения 15 мин образцов,взятых из реакционной смеси.Концентрацию глюкозы, полученнойпутем гидролиэа мелибиозы в ходеданной реакции, определяют калориметрическим методом с использованием калориметра С 00-Рехой фирмы ИаппЬепп Сшб 1,Оптическую плотность окрашенныхобразцов измеряют при комнатной температуре в спектрофотометре Колемана 4 Б,55 фирмы Перкин-Элмер, оптическийпуть лодочки = 0,1 дм при длиневолны 436 мкм.Если эа единицу количества принять то количество Фермента, кото- ырое образует 1 мкг мюкозы в течени2 ч в приведенных выше условиях ана.лиза, то количества фермента на 1 чвысушенных клеток могут быть рассчитаны с помощью следующей формулы: у0 (Е Ь-Е,Л)18 215 100й = хвысушенных кле- Сток, гстандартн. где Е й - оптическая плотность обраэца, взятого через 2 чЕ Ь - оптическая плотность образца, взятого в нулевое вемя (О ч);- оптическая плотность стандартного раствора глюкозы, который содержит18,2 мкг глюкозы на 1 мл;С " количество граммов высушенных клеток в 100 млпитательного раствора.П р и м е р 2. Приготавливаются питательный раствор для разведения, имеющий следующий состав воды, г/л:(ВН), ЯО 5ИМБО 7 Н О 0,5Наг НРО2 Нг О 4,6КН, Р 04. 3ЯаС , 0,1СаСЗ 0,05Дрожжевой экстракт 10Глюкоза 10Перечисленные выше соединения растворяют в деионизированной воде, а затем величину рН доводят до 5,3 с помощью соляной кислоты. Культуры в указанном питательном растворе штамма ЯассЬахошусеэ сехеч 1- з 1 а.ь чах о 1 еасеизприготовленные как описано в примере 1, инкубируют при перемешивании (скорость вращения 180 об/мин)и температуре 27 С,После 39 ч с момента инокулирования клетки питательного бульона собирают путем центрифугирования и промывают фосфатным буферным раствором (0,1 моль; рН = 5,6). Из 100 мл питательного раствора для разведения получают 0,546 г высушенных клеток, Клетки, извлеченные из 100 мл питательного бульона, повтор но суспенэируют в 100 мл фосфатного буферного раствора (0,1 Му рН = 5,6) и определяют их ферментативную актив-. ность: 1 г высушенных клеток содержит 94 10 ферментных единиц.бП р и м е р 3. Приготавливают питательную среду, имеющую следующий состав, г/л;8 1090262 30 Составитель И. ПривалдваРедактор Н. Ковалева Техред С,Легеза Корректор И, Эрдейн . Заказ 2962/56 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Глюкоза 10Мелибиоза 1Перечисленные выше соединения ра-, створяют в деионизированной воде, а величину рН доводят до 5,3 с по мощью соляной кислоты.Культуры штамма,8 ассИагошусев сегечваФ чаг, о 1 еасецв, полученные как описано в примере 1, инкубнруют при перемешивании с круговым враще нием (180 об/мин) при 27 С. После 43 ч с момента инокуляции клетки бульонных-культур собирают путем центрифугирования и промывают их фосфатным буферным раствором (0,1 М; . 5 рН = 5,6), Из 100 мл бульонной культуры получают 0,594 г высушенных кле- ток.Клетки, вьщеленные из 100 мл питательного раствора (бульона), пов торно суспензируют в 100 мл фосфат-. ного буферного раствора (О, 1 М; рН5,6), и определяют ферментатив-, ную активность: 1 г высушенных кле-, ток содержит 1,6 10 ферментных еди ницеП р им е р 4. Приготавливают питательную среду, имеющую следующий состав, г/л:(НН 4), 804 5,0М 804 7 Н О 0,05БаНРО 4 12 Й,ОКН,РО 4 3,0ЯаСХ 0,1Сас 1, 0,05Дрожжевой экстракт 10,0Глюкоза 5,0Мелибиоза 5,0 Перечисленные вьппе соединения растворяют в деионизнрованной воде, а величину рН доводят до 5,3 путем добавления соляной кислоты,Культуры ЯассЬагошусев сегечз а, чаг оеасепв в таком,питательном растворе для разведения, приготовленные как описано в примере 1, инкубируют при пере 1 кешивании с круговым вращением (со скоростью 180 об/мин) при 29 С. После 48 ч с момента инокулирования питательного раствора клетки собирают путем центрифугирования и промывают фосфатным буферным раствором (0,1 М; величина рН = 5,6). На 100 мл питательного раствора для разведения получают 0,365 г высушенных клеток. Вводят 6 мп питательного раствора (бульона) в 50 мл мелассы Вгх (при 35 С); содержащей 1,63 рафннозы (в расчете от общего количества твердого вещества), и величину рН раствора доводят до 5,2 с помощью серной кислоты. Обработку осуществляют при 40 С в течение 16 ч при одновременномоперемешивании, Концентрация галактозы, продукта гидролиза рафиноэы в ходе данной реакции, определяется методом ультрафиолетового анализа Лактоза/Галактоза, разработанным фирмой ВоеЬгпяег Маппйе 1 шСшЬН. При указанных вьппе условиях получается 153 мкмоль галактозы, что эквивалентно гидролизу ЗОХ-ной всей присутствующей рафинозы.