Способ получения эритроцитарного диагностикума

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СЭ,НЦМйщеии УБЛИК. 61 К 39/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оцец о(71) Московский нкий институт. Вакциним. И. И, Мечниковаватеа ский институт(86) 3.,3 оЬпевИ.А Вгц 3 м 5,СаЬе Ч;й. вецп 1 каФоп МйЬ Вйапйз оГ За 1 щопе 11 а щппезойа..Р 5 оХ Ве-Ицйапйе пГ апд 1 паа3977, 17, 1.ВО,1017 ЗЗ 9 84) (87) СПОСОБ НОЛУЧЕНИЯ ЭРИТмРОБИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА цлявыявления .антител путем выцеленщьиз мутанта МбпопеИц вЬп 1 зоФю й 898гпикопипица с после,цукнцей сорбдией егона эратроцитах, о тл и ч а в щ и йс я тем, что, с целью повышения спедифической чувствительности диагностикума, нативный гликопющц сорбируют нзэритропвтах в присутствии бычьего сыво.роточного альбумина.Изобретение относится к медицине,а именно к способам получения эритроцитарного диагностикума для выявлениябелков, способных нейтрализовать биологическую активность энцотоксинов различных грамотрицатепьных бактерий.Известен способ получения эритрс.цитарного циагностикума цля выявления антител путем выделения из мутанта ОВттюпеИЮ е 1 йуиз 0 с Й:595 гликолипида с последующей сорбцией е го на эритроцитах, причем сорбировать гликолипидможно только после обработки его щэлочьюЮОднако известный способ недостаточно чувствителен, поскольку гицролизщелочью приводит к потере антигенныхдетерминант, что снижает чувствительность диагностикума,Белью изобретения является повышение специфической чувствите и ностиэритроцитарного циагностикума.Укаэанная цель достигается тем,что согласно способу получения эритроцитарного циагностикума для выявленияантител путем выделения из мутантазсОеоюЕИсн ОМвчт 50 а Й 595 глико-липида с последующей сорбцией его на эритроцитах, нативный гликолинид сорбируютна эритроцитах в присутствии бычьегосывороточного альбумина.Способ осуществляется спецующим образом,Свежие человеческие эритроциты груьпы О/1 Рн+ отмывают 0,9%-ным раствором хлористого натрия от плазмъ (центрифугируют 15 мин при 2500 (, супернатант отбрасывают, эритроциты вновьсуспенцируют ь физиологическом растворе, процедуру повторяют трижды). Отмь 1 тые эритроциты суспенцируют в стандартном солевом растворе (4 5 г цитратанатрия + 8,8 г хлористого натрия, пистислированной воды до 1 л) цо конечнойконцентрации 5 6% и циализуют противформалина, объем которого составляет1/5 часть от объема суспенцированныхэритроцитов, 8-6 сут при 4-6 о, периоючески помешивая. После циализа эритроциты отмывают от избытка формалинастандартным солевым раствором, готовят80 ф ную суспензию в этом же растворе,добавляют формалин цо концентрации1% и .хранят в таком вице при 4-6 .6 мл 50%-ной суспензии эритроцитов отмывают трижды от формалинастандартным солевым раствором.5 мг танина растворяют в 200 мл0, 18 М натрий фюсфатного буфера (100 мл 0,15 М раствора хлористого натрия+ 100 мл 0,15 М натрий-фосфатногобуфера рН=7,2) суспендируют в этомрастворе формалинизированные эритроциты, инкубируют 10 мин при 37 и.цетрифугируют 15 мин при 2500(.Супернатант отбрасывают, эритроцитысуспендируют в том же буфере, вновьцентрифугируют.К полученной после центрифугирования суспензии эритроцитов добавляют0,3.5 М натрий-фосфатный буфер рН=6,4,содержащий комплекс гликолнпица с,бычьим сывороточным альбумином в 15 концентрации 200 мкг. гликолипидав 1 мл. Дня получения комплекса 10 мггликопипица, полученного хлороформметанопьной экстракцией (2), растворяют в 10 мл деионизированной воды, 20 добавляя триэтиламин до концентрации1,5%, затем добавляют 0,5 мл раствора, содержащего бычий сывороточныйальбумин в концентрации 3. мл/мг, перемешивают и затем отгоняют триэтиламин на роторном испарителе, Послеотгонки триэтиламина комплекс гликолипица с бычьим сывороточным альбумином разводят фосфатным буфером(0,19 М, рН=6,4) так, что концентра ния гликопипида составляет 200 мкг/мл. Далее смесь эритроцитов и комплекса гликолипица с альбумином инкубируют 30 мин при 37 ф, отмывают триж цы стандфртным сопевым .раствором,содержащем 0,03% бычьего сывороточного альбумина, готовят 10% ную суопензию эритроцитов в этом же растворе,,добавляют формалин цо конечной концент рации 0,1% и хранят при 4 еДля постановки реакции пассивнойгемагглютинации готовят 1%-ную сую, пензию эритроцитов в стандартном солевом растворе, содержащем 0,03% аль 45 бумина. В каждую лунку вносят по 50 мкпсоответствующего разведения сыворотки,приготовленного на мединалвероналовоМбуфере рН=8,6 и по 25 мкл 1%-нойсуспензии эритроцитов.В опытах пассивной гемагглютинации (РПГА) кроличьи сыворотки противгликолипида и липица А реагировали сполученным эритроцитарным аиагносимкумом в разведении 1:1024 и 1:256соответственно, тогда как эритроциты,сенсибилизированные только бычьимсывороточным альбумином, агглютилировались теми же сыворотками в разцелении 1:16 и 1:8 соответственно.3 1017339 4Реакция пассивной гемагглютинации , гликопипицом илн липнцом А в конденэ,эритроцитов, сенснбилизированных гли рации 1 мкг/мл.копнпнцом ъ комплексе с бычьим сыво- При сравнйтельном изучении прелроточным адьбумином при добавлении , ложенного диагностнкума с прототипом кроличьих сывороток против гликолипи-(эритроаты, сенсибилизированнйе гщ- ца специфически ингибировались гликоколипнцом или лнпицом А после обработ. липнцом или липицом А в концентра- ки послецних щелочью); в РПГА с ис-ции 0,2 мкгЬюл и 1 мкг/мл соответст- пользованием гипериммунных кроличьих венно. При использовании сывороток сывороток к гликолипиду Ре и липиду А полу- против лнпнца А реакция ингибировалась 10 ченырезультаты,представленныэтабл,1, г о Таблица 1 липид йБСА Нативный .г в комплекс 1: 10 Гликолипид Ре, обратанный щелочью (прототип) А в комплексе с БС обработанны рч Из табл. 1 вицно, что эритроциты, сенсибилиэированные нативиым. гликоли- пнцом йе или Фипкцом А в комплексе с БСА обладают бопьшей чувствительностью в РПГА с антисыворотками против гликолвщца Яе или липица А, чем эритр цйты,исиользовавшиеся в качестве прототип Предложенный диагностикум позволявыявить антитела к гликолидиду Ре:хемотипа и липиду А в тех случаях,43где они не обнаруживаются в РПГА сэритроцитами, сенсибилизировавнымио- гликопнпидом или липидом А после иха. обработки щелочью (табл. 2).:2048 е с инфаркто окар Больные с системнойкрасной волчанкой 1:10:25 рыс после ожога аемый снос фическую чувкума в 2-3выявлять ак и к глиость ио- . ове ч 3423/9 Тираж ВНИИП ясное, Проектная,филиал ППП фПатент", г. Ужго Нормальная с-ка кролков Специфичность предложенного диаг-. ностикума определяли по реакции ингьмбнрования РПГА с гяпериммунной сыво роткой против гликолипида йе. Были изученыдипопописахарицыр Я -форм различных вицов ф-бактерий, лийид А, полученный гнцропизом этих ЛПС, гли колипиц Йе -.хемотнпа, БСА, метилиро ванный БСА, человеческий сывороточный альбумин, дезоксирибонуклеиновая кислота, цекстран сульфат. Имгибирую-. щей активностью обладали только глнколипид ЦФ и липид А.Применение полученного эритроцитар ного диагностикума позволило установить, что в сыворотках зцоровых люцей (доноров) антитела, вызывающие гемвазглютинацию, соцержатся в рецнпрокном титре 21 й 3,7, При брюшном тифе легкой н средней тяжести течения антитела выявлены в титре 240,3+32,8, а при тяжелом течении - в тиаре 49,8112,8. У хронических носителей брюшнотифоэных бактерий антитела выявлены в тит ре 118+24,6,5 Обработка кроличьих сывороток исывороток от бопьных людей 2 меркап тоэтанолом привоаша к резкому сяижь.нию их способности вызвать гемагглютннацию эритроцитов, сенсибилизирован 4 е ных нативным гликолипицом. Эти результаты показывают, что агглютинацию эритроцитов, сенсибнлизированных нативным гликолипицом, . вызывают им муноглобулины класса М или другие 43 белки, имеющие 8-5 связи. Таким образом, прадлпозволяет повысяеь специствитепьность диагностиза, а кроме того позволяантитела как к люпщу Аколипкду, исключая необхпользования двух циагности