Способ получения глюкозоизомеразы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик977491Опубликовано 30.11.82. Бюллетень44Дата опубликования описания 05.12.82 по делам изобретений и вткрмткй(72) Авторы изобретения Московский ордена Трудового Красного Знамени институт пии(евойпромышленности и Всесоюзный научно-исследовательскии биотехнический институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментных препаратов, и может быть использовано в крахмало-паточной и гидролизной промышленностях для получения фруктозосодержащих сиропов из глюкозы, полученной путем гидролиза крахмало- или целлюлозосодержащего сырья.Известен способ получения глюкозоизомеразы путем культивирования микроорганизмов рода Ягер 1 огпусез на питательных 1 о средах, содержащих в качестве активатора биосинтеза фермента глицин и нитрат аммония (по 0,5%) 1. Недостатками способа являются невысокий уровень продуктивности биомассы по 1 глюкозоизомеразе, а также использование дорогостоящего реактива - глицина, что значительно увеличивает стоимость получаемых препаратов глюкозоизомеразы,Также известен способ получения глюкозоизомеразы, предусматриваюший культивирование микроорганизмов рода Ягер 1 отусез на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30 С и перемешивании с последующим отделением биомассы,где в качестве индуктора используют Д-сорбит в концентрации 1,0 вес.% 2. Основным недостатком прототипа является недостаточная эффективность Д-сорбита, используемого в качестве вещества, активирующего биосинтез глюкозоизомеразы, так как он увеличивает продуктивность культуры по глюкозоизомеразе только на 10 - 15%, что является недостаточно высоким показателем. Кроме этого, концентрация вносимого в среду активатора достаточно высока, что приводит к удорожанию питательной среды, а значит, и получаемого препарата глюкозоизомеразы. Цель изобретения - увеличение продуктивности микроорганизмов по глюкозоизомеразе.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкозоизомеразы, предусматривающему культивирование микроорганизмов рода Ягертогпусез на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные солии индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30 и перемешивании с последующим отделением биомассы, в качестве индуктора используют Д-ксилит в концентрации 0,01 - 1,0/о от среды.Изобретение поясняется примерами.Пример 1. Культуру Ягер 1 огпусев аэоцгэеоцэ 28 - 3 (ВКМ А) выращивали в колбах емкостью 700 мл, содержащих по 35 мл питательной среды следующего состава, о/,: Д-ксилоза 1,0; пептон 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; К НРО 0,3; МЯО,.; 7; Н 0 0,1; агар-агар 0,1. Исходный рН питательной среды до стерилизации 7,2. Продолжительность стерилизации 30 мин при 0,5 ати. Засев проводят споровой суспензией, полученной путем смыва воздушного мицелия стерильной водой с культуры, выращенной на скошенной агаризованной среде. Культивирование ведут на круговой качалке при п = 200 об/мин, 30 в течение 40 ч. Выращенный инокулят используют для засева колб емкостью 750 мл, содержащих по 50 мл среды вышеописанного состава, в которую вместо Д-ксилозы вносили Д- ксилит или Д-сорбит в концентрации 1,0 вес. /о. Доза засева составляет 10 об. /о. Исходный рН сред до стерилизации 7,2. Продолжительность стерилизации 30 мин при 0,5 ати. Культивирование вели в течение 24 ч на круговой качалке при и = 200 об/мин, 30. После окончания культивирования выращенную культуру центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин (центрифуга ЦЛС-ЗМ). В полученном супернатанте определяли значение рН, а осадок дважды промывали дистиллированной водой для удаления остатков питательной среды. Промытую биомассу используют для определения глюкозоизомеразной активности. Для этого готовят изомеразационную смесь следующего состава: Д фруктоза 2 О М; Мд 804 Х Х 7 НО 5 Оз М, фосфатный буфер рН 7,0 0,05 М. К 5 мл изомеризационной смеси, термостатированной при 70 в водяной бане, добавляют примерно 100 мг влажной биомассы продуцента. Полученную суспензию термостатируют при постоянном перемешивании в течение 30 мин при 70, после чего колбочку с суспензией охлаждают в ледяной бане для остановки реакции изомеризации. Количество образовавшейся Д-глюкозы определяют автоматически на глюкозном анализаторе фирмы ВесЬпап. За единицу активности (МГлИЕ) принимают количество фермента, необходимого для получения 1 мм Д-глюкозы из Д-фруктозы в минуту при 70 и описанных выше условиях изомеризации. Расчет продуктивности штамма по глюкозоизомеразе ведут, подсчитывая количество МГлИЕ, полученных с литра питательной среды. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Результаты определения активности глюкозоизомеразы и продуктивности культуры, полученные после культивирования штамма 81 гер 1 огпусез а 1 эодпвеоцв 28 - 3 на питательной среде, содержащей Д-ксилит, в сравнении с другими углеводами приведены в табл. 1. Из данных табл. 1 следует, что добавление в питательную среду Д-сорбита приводит к увеличению продуктивности культуры по глюкозоизомеразе на 13/о, а внесение Д-ксилита в той же концентрации увеличивает продуктивность культуры по глюкозоизомеразе на 65/О Пример 2. Получение биомассы и определение активности глюкозоизомеразы проводят так, как это описано в примере 1. На стадии ферментации используют питательные среды, составы которых приведены в табл, 2. Исходный рН сред1 - 4 до стерилизации составляет 7,0, а среды Ло 5 6,2. Результаты определения продуктивности мицелия, полученного при культивировании на этих средах в присутствии 0,1 вес. /, Д-ксилита и без него, представлены также в табл. 2. Как можно видеть, внесение Д-ксилита даже в концентрации 0,1 вес./о оказывает значительное стимулирующее влияние на биосинтез глюкозоизомеразы. Продуктивность культуры по глюкозоизомеразе увеличивается в зависимости от состава питательной среды в 2 10 раз.Пример 3. Получение биомассы и определение актиьности проводят так, как это описано в примере 1. На стадии ферментации используют питательные среды1 - 5 (табл. 2, пример 2), в которые вносят Д- ксилит в концентрациях от 0,01 до 0,2 - 0,3 вес. /о. Результаты определения продуктивности мицелия по глюкозоизомеразе представлены в табл. 3.Анализ результатов позволяет сделать вывод о том, что насыщающей концентрацией Д-ксилита является концентрация 0,1 - 0,2 вес.о/,. Снижение концентрации Д-ксилита ниже 0,01 О/о не выгодно из-за незначительности оказываемого стимулирующего эффекта, увеличение же концентрации Д- ксилита выше 1,0 вес.о/, невыгодно из-за возрастания стоимости питательной среды без соответственного увеличения стимулирующего эффекта.Применение предлагаемого способа получения глюкозоизомеразы позволяет в 2 - 10 раз увеличить продуктивность биосинтеза глюкозоизомеразы. Кроме того, ввиду невысокой стоимости Д-ксилита (2 руб/кг) и малой концентрацией его в питательной среде себестоимость единицы активности глюкозоизомеразы остается прежней или снижается.977491 Табл и ца 1 Продуктивность культуры продуцента на средах с различными углеводаии-индукторами(контроль) 24,6 1555 135 0 1657 140,0 256 1,0 100 Д-сорбит Д-ксилит 1,0 113 165 1,0 Таблица 2 Кор-СахаПак- тоза КисМочевина КисМеБио- рНмасса кон. лас- К НРО и 50 7 Н,о Д-ксиАктивностьглюко оизомеразы Среда роза потный лотный са лит вые дрожгидгидролиролизат жи зат овсяной кормошелу. вых дрожжей хи по с,в.3 по МглИЕ/л пит среды г влажчойбиом/л по РВ с,в. пит.среды О 22 1 0 1,0 О 22 1,0 1 О 0,3 0,1 207 7,73 208 7,61 227 7,45 258 7,43 201 7,79 199 7,77 223 7,51 207 7,60 254 7,31 245 7,24 3146 0,3 О, 1 0,1 0)22 1)0 0,22 1,0 282 1,0 0,3 0,11,0 0,3 0,1 0,1 1876 437 0,22 1,0 0,22 1,0 0,3 0,1 2457 0,3 0,1 О,1 0,22 1,О0,22 1,0 2,0 0,3 0,1 257 2,0 0,3 0,1 0,1 2523 1,0 0,22 1,0 0,22 5 2,5 0.3 0,10,3 О,1 2,5 6792 Продуктивность биомассы и синтез Фермента при культивировании на средах различного состава с внесением и без внесения Д-силиката,01 ,05 ,10 ,20 122 118 125 134 135 1072 1556 2172 3014 3,74 7,05 6,89 7,43 7,58 7,21 0 0,01 0,05 О, 10 0,20 разе в ксилит среды. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Англии Мю 1395053,кл. С 12 Р 13/10, опублик. 1975.2. Патент США Мо 3654080,кл. С 12 Р 13/10, опублик, 1972 (прототип),Тираж 505 Подписное Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретенияСпособ получения глюкозоизомеразы, предусматривающий культивирование микроорганизмов рода Ягер 1 огпусез на питательной среде, содержащей источник угле рода, источник азота, минеральные соли и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30 С и перемешивании с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что, с целью увеличения продуктивности микроорганизмов по глюкозоизомеВНИИПИ Заказ 9117/32 Филиал ППП Патент, г. качестве индуктора используют Д- в концентрации 0,01 - 1,00 % от